Эффективный протокол для оценки модуляции активности ERK на ранних моделях синдрома данио-рерио Нунан с помощью живой FRET-микроскопии и иммунофлуоресценции

Мы создаём модель сложных заболеваний развития на основе данио, связывая секвенирование пациентов с функциональной геномикой, чтобы поддерживать интерпретацию вариантов и доклинические испытания лекарств. Несмотря на улучшенные сенсоры FRET, надёжный in vivo тест, обнаруживающий тонкие патогенные изменения сигнализации Ras-MAPK с достаточной пространственно-временной чувствительностью, остаётся отсутствующим. Для начала разместите специальную микроинжекционную пластину с формованной 2%агарозой в среде E3 на рабочую платформу.

Расположите и выровняйте оплодотворённую икру подростковых данио-рерио-ревиора в тарелке по соответствующим полосам, чтобы ограничить движение яиц во время микроинъекции. Обратная загрузка иголки двумя микролитрами инъекционного материала с помощью пипетки микрозагрузчика. Отрегулируйте давление и время, чтобы калибровать каждую инъекцию в зависимости от качества иглы и эмбриона на микроинъекционном устройстве.

Ввести раствор в одноклеточную стадию эмбрионов подросткового данио-рерио. Выращивание микроинъекционных эмбрионов подростков в условиях контролируемого содержания. Очистите все яйца, которые выглядят мутными или дегенерированными, в течение трёх часов после отложения.

Примерно через четыре часа после оплодотворения, используя стандартный флуоресцентный стереомикроскоп, установлен в диапазоне длин волн от 465 до 500 нанометров. Проверьте эмбрионы на флуоресцентное репортёрское выражение. Выберите подростковых положительных рыб для FRET-визуализации и резервируйте отрицательных братьев и сестёр для иммуногистохимических оценок.

Поместите эмбриональные бассейны равного количества в разные колодцы пластины с шестью колодцами. Для начала лечения погрузите эмбрионы в три миллилитра среды E3, содержащей транспортный контроль в виде DMSO или разбавленного MEK в нужной концентрации. Для начала расплавите агарозу с низким уровнем плавления 1,5%–2% в термомиксере при температуре 50 градусов Цельсия.

После растворения снизите температуру примерно до 30 градусов Цельсия. Разместите один инъекционный подростковый положительный эмбрион в центр стеклянной чаши диаметром 35 мм для живой съёмки. Удалите лишнюю среду E3 и добавьте каплю малоплавящего агарозы, чтобы обездвижить эмбрион.

Дайте агарозе полимеризироваться при комнатной температуре. Включите контроллер инкубатора как минимум за час до получения и установите температуру на 28 градусов Цельсия для поддержания здоровья эмбриона. Когда инкубатор стабилизируется, поместите образную антенну с эмбрионом на держатель образца и используйте 10-кратный сухой объектив для визуализации образца.

Включите аргон-ионный лазер и отрегулируйте мощность лазера на 50%. В аппаратных настройках выберите разрешение глубины восемь бит для получения изображений. Далее, в панели Acquisition, выберите спектральное обнаружение xy, гамма, лямбда, z и установите формат изображения на 512 на 512 пикселей, скорость сканирования 400 герц и оптический зум 0,75. Активируйте 458-нанометровую лазерную линию аргонового ионного лазера и установите её значение интенсивности на 8,5%, затем выберите гибридный детектор и установите его чувствительность на коэффициент усиления 500.

Откройте выпадающее меню на панели детектора, чтобы выбрать кривая эмиссионного белка циан-флуоресценции или ECFP. Для отображения кривой излучения YPET активируйте второй детектор. Затем выберите кривую эмиссионного излучения желтого флуоресцентного белка YFP.

Чтобы начать живые захваты, разместите курсор обнаружения в диапазоне наиболее интенсивного сигнала YFP, чтобы визуализировать образец. Задайте начальную и конечную позиции толщины образца в окне Z-Stack LASX. Установите свойства диапазона гамма-сканирования так, чтобы оно начиналось с 460 нанометров и заканчивалось на 570 нанометрах радиуса обнаружения.

Определите полосу пропускания обнаружения как пять нанометров, а размер шага сканирования — как пять нанометров. Начинайте приобретение z-stack. Вставьте и сохраните два адаптированных эталонных эмиссионных спектра для CFP и YFP в базу красителей, доступную в окне конфигурации, чтобы исключить спектральное проточение.

Выберите полученный спектральный файл изображения из сессии визуализации и откройте окно процесса. Далее, в инструменте разделения красителей, выберите Спектральное разделение красителей и настройте настройки разделения красителей. В выпадающих списках слева от диалога выберите новый спектр выбросов CFP в первой позиции и новый спектр излучений YFP из базы данных спектра.

В гамма-сканировании изображений определите изображение с наибольшей интенсивностью сигнала. Затем двигайтесь по z-сканированию, чтобы выбрать оптическую секцию, которая подсвечивает интересующую область на зоне поля. Активируйте режим выбора ROI на зоне маргиналы полюса животного, чтобы определить область с наилучшим спектром.

Нажмите на прицел ROI в окне и отрегулируйте размер опорного ROI до 40 вокселей в области измерений. Откройте недавно сгенерированный файл, содержащий два разделённых канала. Создайте двумерное проекционное изображение из трёхмерной серии изображений с максимальной интенсивностью.

В окне «Процесс» выберите «обрезать», чтобы разделить каналы на два отдельных файла: канал один и канал два. В окне «Процесс» выберите «Объединить изображения», затем выберите файл второго канала и вставьте его в первый вариант. Затем выберите файл первого канала и вставьте его во второй вариант.

Установите масштабирование с коэффициентом пять и выберите операцию соотношения. Нажмите «Применить», чтобы сгенерировать новый файл с изображением метрики отношений. Сохраните файл для анализа данных.

Импортируйте файлы изображений спектральной визуализации и разделения красителей в открытое программное обеспечение Fiji для анализа. Настройте параметры для измерений показаний на Фиджи с помощью Analyze и Set Measurements. Выбирайте площадь, интегрированную плотность и среднее значение серого в качестве интересующих параметров.

Используя инструмент выбора полигонов с панели инструментов, выберите область, соответствующую краю гаструлы. Последовательно нажмите «Анализ», «Инструменты» и «ROI Manager», чтобы сохранить спецификации ROI xy. Чтобы выполнить измерения с выбранным ROI, нажмите «Анализировать и измерять».

Организуйте FRET по коэффициентам CFP для каждого ROI в рабочем листе с экспериментальными группами в столбцах и исходными значениями в строках. Для одной биологической реплики создайте столбцовую таблицу с одной группирующей переменной, где каждая группа определяется столбцом. В конце гаструляции фиксируйте эмбрионы, погружая в 4% паральдегид, приготовленный в PBS, в течение 20 минут при комнатной температуре.

После фиксации промывайте эмбрионы несколько раз с помощью PBS. С помощью пасторской пипетки ориентируйте эмбрионы боковой стороной в одном колодце пластины на 12 ямак, содержащей свежую PBS. Используя стереомикроскоп с объективом увеличения 2,7x, сканирующей объективом 0,63x и коэффициентом увеличения 8,6, снимайте изображения в режиме яркого поля для оценки наличия овальной формы.

Импортируйте захваченный эмбрион в программное обеспечение Fiji. Чтобы измерить длину осей эмбриона, выберите прямой инструмент на панели инструментов и нажмите «Анализировать», затем «Измерить». После выполнения выбранных измерений добавьте их в список менеджеров ROI и сохраните файл ROI.

Экспортируйте данные в рабочий лист. Вычислите отношение осей, деля длину большой оси на длину малой оси. Вычислите среднее, стандартное отклонение среднего значения или стандартную ошибку среднего значения разных репликат.

Наш живой конвейер FRET у данио-рерио позволяет раннее чувствительное обнаружение активации патогенных сигнальных сигналов ERK, поддерживая интерпретацию вариантов и тестируя эффективность ингибиторов MEK.