Модифицированный метод наиболее вероятного числа для количественного определения сальмонеллы в сырых и полуфабрикатах из куриных продуктов

Наши исследования разрабатывают технологии быстрого обнаружения, количественной оценки и характеризации патогенов пищевого происхождения, уделяя особое внимание чувствительным методам, которые могут повысить безопасность пищевых продуктов за счет идентификации загрязнения в реальных условиях. Основные проблемы включают в себя быстрое обнаружение чувствительных матриц и сложные матрицы с недорогими, но масштабируемыми решениями. Мы также устраняем трудности, связанные с уменьшением количества ложных срабатываний и улучшением совместимости с различными средами тестирования.

Для безопасности пищевых продуктов это означает точное обнаружение патогенов при низких концентрациях в различных пищевых матрицах. Наш протокол устраняет разрыв между выявлением распространенности и количественной оценкой сальмонеллы, чтобы обеспечить детерминированные значения уровня загрязнения пищевых продуктов. Этот процесс является минимально разрушительным, поскольку он включает в себя валидированные анализы, используемые в протоколах FSIS, и достаточно гибок для размещения дополнительных патогенов и пищевых матриц.

Для начала поместите куриный фарш, приобретенный в отделе свежего мяса местных розничных продавцов, на рабочую платформу. Асептически разделите мясо на 25 граммовых образцов. Приобретайте готовые к приготовлению куриные продукты в отделе замороженных продуктов местных розничных продавцов и асептически разделяйте их на 25-граммовые образцы.

Полоса сальмонеллы enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 на пластине шнека для инфузии сердца мозга. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день привите 25 миллилитров отвара мозговой инфузии сердца одной колонией свежевыращенной сальмонеллы.

Аэробно выращивайте культуру в течение ночи при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 100 об/мин. Чтобы приготовить серию десятикратного разведения, перелейте 0,5 миллилитра культуры в 4,5 миллилитра буферной пептидной воды или BPW и тщательно перемешайте. Затем переведите 0,5 миллилитра из приготовленного разведения в 4,5 миллилитра BPW для каждого последующего разведения.

Далее асептически переложите 25 грамм облученного куриного фарша в стерильные желудочные пакеты. Инокулируйте образец одним миллилитром нужной концентрации разведения культуры. С помощью стерильного разбрасывателя клеток аккуратно равномерно распределите инокулянт по поверхности курицы и дайте ей постоять при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа.

После инкубации облученных образцов куриного фарша с культурой сальмонеллы в течение одного часа добавьте 225 миллилитров BPW в каждый образец для достижения желаемого соотношения образца к среде. Гомогенизируйте образцы курицы с помощью желудка с нормальной скоростью в течение 120 секунд. С помощью пипетки объемом 50 миллилитров осторожно извлеките жидкость из фильтрованной стороны желудка и разделите ее на две стерильные центрифужные бутылки.

Центрифугируйте образцы при 10 000 G в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в трех миллилитрах BPW с помощью стерильного шпателя. Добавьте 12 миллилитров BPW в ресуспендированную гранулу и тщательно перемешайте, помешивая стерильной лопаткой.

Соедините содержимое обеих бутылок центрифуги в одну бутылку. Добавьте три миллилитра ресуспендированной пробы в каждую лунку в первой колонне блока из 48 лунок, чтобы создать восемь повторов. Чтобы приготовить серию десятикратного разведения в колонках с первой по шестую с помощью восьмиканальной пипетки, добавьте 0,3 миллилитра образца из каждой лунки в 2,7 миллилитра BPW в следующей колонке, обеспечивая тщательное перемешивание.

Инкубируйте блоки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 100 об/мин. На следующий день с помощью многоканальной пипетки нанесите семь микролитров культуры из каждого разведения на шнековые пластины для инфузии сердца мозга в виде сетки четыре на шесть. Дайте планшетам высохнуть в течение 10 минут, прежде чем инкубировать их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18–24 часов.

После инкубации осмотрите пластины шнека, отметив как положительную хотя бы одну колонию, а отсутствие роста как отрицательную. Введите номер разбавления и коэффициент разбавления на листе. Введите соответствующий объем или вес образца.

Затем укажите количество повторов и введите количество образцов, которые дали положительный результат. Нажмите на кнопку «Вычислить результаты», чтобы проанализировать аннотированные положительные и отрицательные результаты с использованием простого метода максимального вероятностного разрешения. Для начала настройте блок МПН на 48 лунок для культуры сальмонеллы, инокулированной образцами курицы.

Смешайте культуры в блоке на 48 лунок, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Перелейте по 200 микролитров каждой культуры в 96 луночный ПЦР-планшет. Запечатайте планшет и центрифугуйте при температуре 6 600 G в течение 10 минут.

Снимите надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 20 микролитров реактива для набора для экстракции ДНК. Перемешайте гранулы, пипетируя вверх и вниз. Снова запечатайте пластину и нагрейте ее при температуре 99 градусов Цельсия в течение 10 минут, после чего охладите до 20 градусов Цельсия.

После центрифугирования используйте два микролитра надосадочной жидкости для приготовления смеси QPCR в соответствии с установленным протоколом. Используя следующие условия, проведите ПЦР в реальном времени. После ПЦР экспортируйте результаты и сочтите лунки с пороговыми значениями цикла меньше или равными 30 положительными и более 30 отрицательными.

Смешайте культуры в блоке на 48 лунок, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Перенесите 20 микролитров каждого образца в набор для молекулярного обнаружения сальмонеллы, предоставленный пробиркой для лизиса. Нагрейте образцы до 100 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Затем инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре. Перелейте по 20 микролитров лизата из каждой пробирки для лизиса в пробирку с реагентом и загрузите пробирки с реагентом в держатель. Добавьте держатель с пробирками с реагентами к прибору системы молекулярного детектирования.

Настройте параметры программного обеспечения для анализа системы молекулярного детектирования. Запустите анализ и экспортируйте отчет для анализа. Отчет MDS Run содержит подробные выходные данные, которые могут быть положительными или отрицательными.