Автоматизированное и высокопроизводительное микробное моноклональное культивирование и сбор с использованием системы омиксной культуры микролитровых капель для одноклеточных микролитров

В этом исследовании изучается омика микробных культур с использованием автоматической платформы для улучшения микробной изоляции, культивирования и моноклонального скрининга. Цель состоит в том, чтобы улучшить понимание кишечника человека, микробиома и их применения. Технологи, продвигающие исследования микробиома, включают в себя отказ от микрофлюидики, автоматические платформы для выделения и скрининга штаммов, алгоритмы машинного обучения и моноклональные дозаторы для омики культур с высокой деформацией и анализа микробиома.

Система промежуточных клеток значительно улучшает микровью, моноклональную изоляцию и окраску, генерируя почти вдвое большее количество клонов по сравнению с традиционными методами, тем самым расширяя возможности исследований в смеси культур кишечного микровида. Этот протокол направлен на удовлетворение потребности в недорогой платформе микробного скрининга с высокой поддержкой, преодолевая ограничения традиционных методов в эффективности и возможности оценки для исследования смесей культур. Наша лаборатория в дальнейшем сосредоточится на интеграции дополнительных технических средств работы с каплями, таких как разделение и слияние капель, для расширения сферы технологических приложений.

Для начала откройте дверцу камеры генерации и культивирования капель ячейки MISS. Вертикально снимите защитную крышку микротрубки и микрофлюидной микромикросхемы, генерирующей капли. С помощью одноразового шприца добавьте 10 миллилитров стерильной дистиллированной воды в увлажнитель воздуха внутри камеры и установите на место защитный чехол.

Откройте стерильную упаковку микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель и вертикально поместите его прямо над камерой выращивания. Затем в интерфейсе программного обеспечения нажмите «Установка». Когда появится всплывающее окно с подтверждением, нажмите «Да», чтобы начать установку.

Выньте средство для удаления пузырьков воздуха и закрепите его вверх ногами на месте удаления пузырьков воздуха в камере. Прикрепите капельную выходную трубку устройства для удаления пузырьков воздуха к зажимному клапану под ним. Проведите его через все отверстие, ведущее к камере обнаружения и сбора капель.

Открыв дверцу камеры, вертикально вставьте детекторную трубку в гнездо обнаружения. Убедитесь, что трубка обнаружения полностью вставлена. Затяните винт, крепящий трубку обнаружения по часовой стрелке.

После подтверждения полного введения и фиксации закройте дверцу камеры. Подсоедините каждую из 10 силиконовых трубок от микрофлюидного чипа с маркировкой от L1 до L10 к соответствующим пронумерованным зажимным клапанам. Затем подключите быстроразъемный разъем от микрофлюидного чипа к соответствующему порту в системе omic, соблюдая правильные соединения.

После завершения установки стружки появляется всплывающее окно с сообщением «Клапан смыкания капельной трубки открыт». Нажмите OK, когда установка микротрубок и микросхем генерации капель будет завершена. Убедившись, что все трубки правильно прикреплены к соответствующим зажимным клапанам, нажмите OK.

Перед выполнением инициализации нажмите на интерфейс настроек, чтобы настроить соответствующие параметры, такие как селективный режим, температура инкубации, время инкубации, скорость мешалки, длина волны обнаружения наружного диаметра, а также длина волны возбуждения и излучения для обнаружения флуоресценции. Перейдите в главный интерфейс и нажмите кнопку «Инициализировать». Появится всплывающее окно подтверждения, нажмите «Да», чтобы позволить системе ИС выполнить самопроверку своих компонентов, включая насос впрыска, настройки температуры, тестирование сброса отработанной жидкости, модуль скрининга и модуль обнаружения капель.

После завершения инициализации нажмите OK во всплывающем окне. Чтобы получить образец, берут микробный образец и проводят серийное разведение соответствующей средой для достижения концентрации около 50 клеток на миллилитр с получением суспензии образца объемом 40 миллилитров. Затем открутите крышку флакона с образцом и вылейте разведенную фекальную суспензию в флакон с помощью магнитной мешалки, вплоть до места добавления образца.

Закрутите колпачок и надежно закрутите его. Затем вставьте быстроразъем А в быстроразъем В, чтобы завершить процесс загрузки образца. После установки флакона с образцом в указанное положение отделите быстроразъемные соединения A и B от флакона с образцом.

Подсоедините быстроразъемный разъем A флакона с образцом к порту O3 на системе omic. Подсоедините разъем C3 на микрофлюидном чипе к быстроразъемному разъему B и закройте дверцу камеры. В главном интерфейсе программного обеспечения выберите желаемое количество генерируемых капельных трубок и нажмите кнопку «Создать», чтобы начать генерацию капель для одной клетки.

Дождитесь всплывающего окна с сообщением о завершении создания дроплета, и нажмите OK. Закройте зажим на трех разъемах и снимите флакон с образцом. В главном интерфейсе программного обеспечения выберите тот же номер капельной трубки, который использовался при генерации капель.

Нажмите на культуру. Подтвердите время и температуру выращивания и начните процесс. Дождитесь всплывающего окна, свидетельствующего о завершении выращивания капель.

Нажмите кнопку УФ-излучения на системе OMIC, чтобы включить ультрафиолетовое излучение. Облучайте камеру обнаружения и сбора капель в течение 30 минут, прежде чем выключить ее. В супер чистом скамейке откройте все 96 луночных планшетов, используемых для сбора капель, и сложите их друг на друга без крышек, последовательно нумеруя их снизу вверх.

Следите за тем, чтобы верхняя пластина колодца была закрыта крышкой. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель и установите луночные пластины в отведенные для этого места. Снимите крышку с верхней пластины лунки, затем закройте дверцу камеры.

Снова включите ультрафиолетовый свет на системе omic на 30 минут, чтобы выполнить вторичную стерилизацию. Далее снимите средство для удаления пузырьков воздуха с места размещения. Открутите крышку и снимите винт в форме бабочки с крышки.

Налейте 200 миллилитров масла для удаления пузырьков воздуха в средство для удаления пузырьков воздуха. Плотно зафиксируйте колпачок, затем закрепите средство для удаления пузырьков воздуха вверх ногами в предназначенном для этого месте. В домашнем интерфейсе выберите капельную трубку для сортировки.

Нажмите «Сортировка». Введите количество луночных пластин, которые необходимо собрать, и начните процесс сортировки. Наблюдайте за областью отображения процесса для измерения оптической плотности капель или значений флуоресценции в режиме реального времени.

Проанализируйте примерно от 20 до 30 капель, чтобы проверить значение наружного диаметра. Если большинство капель имеют ОД около 0,2, установите нижний порог ОД равным 0,5, а верхний порог ОД равным четырем. Система будет автоматически собирать капли в пределах этого диапазона в 96 луночных планшетах.

Дождитесь всплывающего окна с сообщением о завершении сортировки и сбора капель, а затем нажмите OK. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель. Поместите крышку лунной тарелки на верхнюю пластину лунки и снимите пластины вместе.

Нажмите кнопку «Экспортировать данные», чтобы сохранить собранные данные о сигнале капли. Щелкните тепловую карту. Выберите файл данных о сборе капель и наблюдайте за внешним диаметром, отображаемым в формате микропланшета.

Визуализируйте эти значения наружного диаметра в виде тепловой карты, где интенсивность цвета соответствует распределению наружного диаметра по скважинам, обеспечивая четкое и интуитивно понятное представление. На семейном уровне сравнивали видовое разнообразие микробиоты кишечника человека, полученное с помощью омической системы, метода твердой пластины и исходного образца кала. 34 микробных семейства были обогащены как методом твердых пластин, так и продемонстрированным методом омикса, при этом омическая система дополнительно обогатила четыре семейства.

Омическая система также эффективно обогатила некоторые семейства с низкой численностью. На уровне родов оба метода обогатили 74 рода микроорганизмов, в то время как клеточный метод MISS дополнительно обогатил 13 родов. Кроме того, два рода, первоначально присутствовавшие при низкой численности, были эффективно обогащены с использованием системы OMIC.

Эти результаты показали, что метод культивирования клеток MISS обеспечивал лучшие условия роста для тех штаммов, которые присутствовали в низких пропорциях или имели плохие показатели роста в исходной микробной суспензии.