Флуоресцентное детектирование активности нуклеазы FEN1 и скрининг низкомолекулярных ингибиторов
27 июня 2025 г.
Этот протокол описывает биохимический анализ гелеобразного сдвига для измерения активности FEN1 (Flap Endonuclease 1) и выработки ингибитора.
Мы разработали флуоресцентный метод для обнаружения активности нуклеазы FEN1 и скрининга низкомолекулярных ингибиторов, улучшив диагностику и целевые терапевтические исследования.
Текущие проблемы экспрессии включают в себя сложность и проблемы безопасности традиционных методов, а также высокую стоимость и специализированное оборудование, необходимое для существующих методов на основе флуоресценции.
Этот протокол устранил недостатки традиционного радиологического метода и дорогостоящих флуоресцентных методов, обеспечивая более безопасное, эффективное и простое в использовании решение для обнаружения.
Наша лаборатория сосредоточится на оптимизации высокопроизводительной скрининговой платформы для изучения in vivo применения и механизмов ингибиторов FEN1 в терапии рака.
[Инструктор] Для начала спроектируйте олигонуклеотидные цепи ДНК на основе специфической активности расщепления FEN1. Смешайте одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК в буфере для отжига. Добавьте 10 микролитров буфера для отжига и деионизированную воду, чтобы получился общий объем 50 микролитров. Затем нагрейте реакционную смесь до 100 градусов Цельсия в течение одной минуты в металлической ванне. Немедленно перенесите трубку на температуру 72 градуса Цельсия и выдерживайте в течение 10 минут. Затем выключите источник тепла и дайте раствору постепенно остыть до комнатной температуры, чтобы сформировать полный двухцепочечный субстрат ДНК. Для анализа активности нуклеазы FEN1 сначала соедините два микролитра субстрата ДНК с нуклеазой FEN1 в реакционном буфере. Инкубируйте реакционную смесь в металлической ванне при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Добавьте 20 микролитров в буфер 2X, чтобы остановить реакцию. Затем загрузите 20 микролитров прекращенного образца в заранее приготовленный 12% денатурирующий полиакриламидный гель. Электрофорировать гель при напряжении 100 вольт в течение 60 минут. После завершения визуализируйте результаты электрофореза с помощью системы флуоресцентной визуализации. С помощью пипетки перелейте два микролитра диметилсульфоксида в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте в пробирку два микролитра нуклеазы FEN1 и 10 микролитров реакционного буфера 2X и шесть микролитров деионизированной воды. Тщательно перемешайте раствор, после чего выдержите его на льду в течение 10 минут. После инкубации пипеткой пипетируйте два микролитра субстрата ДНК, чтобы получить конечный объем реакции 20 микролитров. Затем готовят рабочее разведение ингибитора нуклеазы FEN1 FEN1-IN-4 путем проведения двукратного серийного разведения из одномолярного раствора в диметилсульфоксиде. Пипеткой наберите по два микролитра нуклеазы FEN1 и разведенного ингибитора FEN1-IN-4 в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем пипетируйте 10 микролитров 2X реакционного буфера и четыре микролитра деионизированной воды. Аккуратно перемешайте и выдержите смесь на льду в течение 10 минут. Теперь добавьте в пробирку два микролитра субстрата ДНК, чтобы итоговый объем составил 20 микролитров. Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в металлической ванне в течение 15 минут. Затем завершите реакцию, добавив 20 микролитров терминирующего буфера. Прозрачная белковая полоса на уровне около 45 килодальтон подтвердила успешную очистку нуклеазы FEN1 от индуцированной экспрессии. Меченный флуоресцеином двухцепочечный субстрат ДНК появился при концентрации 80 килодальтон, что подтверждает успешный синтез по сравнению с одноцепочечной субстратом при концентрации 59 килодальтон. Нуклеаза FEN1 расщепляла 80-нуклеотидный двухцепочечный субстрат ДНК дозозависимым образом, при этом полное расщепление наблюдалось при 0,5 мкг на микролитр. Соединение FEN1-IN-4 значительно ингибировало расщепление двухцепочечного субстрата ДНК FEN1, о чем свидетельствует удержание 80-нуклеотидной полосы. FEN1-IN-4 снижал активность нуклеазы FEN1 в зависимости от концентрации, с половинной максимальной ингибирующей концентрацией 14,03 микромоляра.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен биохимический анализ на основе флуоресценции для оценки активности FEN1 (флап-эндонуклеазы 1) и содействия разработке низкомолекулярных ингибиторов. Работа направлена на преодоление ограничений, связанных с традиционными методами, и предлагает более безопасное и эффективное решение для детекции активности FEN1, имеющее значение для терапии рака.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Ферментативные анализы
- Биохимический скрининг
- Терапия рака
Теоретические основы
- FEN1 играет критическую роль в метаболизме ДНК.
- Современные методы детекции сложны и дорогостоящи.
- Данное исследование направлено на решение этих проблем с помощью более удобного в использовании протокола.
Используемые методы
- Флуоресцентное определение активности нуклеазы FEN1
- Биохимический анализ с использованием двухцепочечных ДНК-субстратов
- Метод высокопроизводительного скрининга ингибиторов FEN1
Основные результаты
- Метод анализа успешно выявил расщепление двухцепочечной ДНК под действием FEN1.
- Новое соединение, FEN1-IN-4, ингибировало нуклеазную активность концентрационно-зависимым образом.
- При определенных концентрациях наблюдалось значительное расщепление, что подтверждает эффективность анализа.
Выводы
- В данном исследовании представлен практический метод оценки активности FEN1 и скрининга ингибиторов.
- Полученные результаты имеют важное значение для разработки таргетной терапии рака и биомолекулярных исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Флуоресцентный метод определения активности нуклеазы FEN1 отвечает критической потребности в создании более безопасных, масштабируемых и количественных анализов для поиска новых онкологических препаратов. Данный метод позволяет быстро оценить роль FEN1 как значимой мишени при раке и поддерживает высокопроизводительный скрининг низкомолекулярных ингибиторов, что напрямую влияет на сортировку портфеля препаратов на ранних стадиях и снижение механистических рисков. Его внедрение оптимизирует переход от валидации мишени к идентификации ведущих соединений в рамках терапевтических линий, ориентированных на репарацию ДНК.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать ферментативную функцию FEN1 в путях, имеющих значение для патогенеза заболеваний.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки нуклеазной активности и эффектов ингибиторов.
- Обеспечивает прогностическую уверенность в FEN1 как в терапевтической мишени для онкологических портфелей препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимый флуоресцентный анализ для надежного скрининга ингибиторов.
- Позволяет получать количественные данные, подходящие для построения кривых «доза-ответ» и определения IC50.
- Снижает операционные риски по сравнению с протоколами на основе радиоизотопов.
- Поддерживает стандартизацию анализа и масштабируемость для высокопроизводительных рабочих процессов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров, связывая активность FEN1 с фенотипами рака.
- Обеспечивает преемственность от биохимической валидации к доклинической оценке ингибиторов.
- Поддерживает продвижение кандидатов, нацеленных на FEN1, с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ на основе флуоресценции позволяет проводить валидацию мишени FEN1 и скрининг ингибиторов на этапе перехода от ранних этапов поиска к идентификации соединений-лидеров, обеспечивая плавную интеграцию в циклы исследований и разработок в области онкологии.
- Открывающая биология: Количественная оценка активности FEN1 для выяснения механизмов репарации ДНК и подтверждения взаимодействия с мишенью.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных количественных показателей эффективности и селективности ингибиторов.
- Аналитика: Возможность статистического сравнения активности фермента при различных условиях и воздействии различных соединений.
- Трансляционные исследования: Связь биохимических открытий с моделями заболеваний путем поддержки отбора кандидатов на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Создание многократно используемой платформы для текущих кампаний по поиску и скринингу соединений, связанных с FEN1.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогностической значимости FEN1 как мишени для терапии рака и снижает неоднозначность механизмов действия.
- Операционная ценность: повышает безопасность, воспроизводимость и пропускную способность анализа при скрининге ингибиторов.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также эффективно распределять капитал при определении приоритетности мишеней репарации ДНК.
- Влияние на портфель проектов: способствует продвижению проектов с учетом рисков и стандартизации между программами в области онкологических исследований.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области энзимологии и разработки методов анализа с использованием флуоресценции.
- Необходим доступ к системам флуоресцентной визуализации и оборудованию для гель-электрофореза.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения сопоставимости и воспроизводимости данных.
- Метод может быть адаптирован для использования различных ДНК-субстратов и библиотек ингибиторов для расширения области применения.
- Стабильность результатов зависит от тщательной оптимизации условий реакции.
