Флуоресцентное детектирование активности нуклеазы FEN1 и скрининг низкомолекулярных ингибиторов
27 июня 2025 г.
Этот протокол описывает биохимический анализ гелеобразного сдвига для измерения активности FEN1 (Flap Endonuclease 1) и выработки ингибитора.
Мы разработали флуоресцентный метод для обнаружения активности нуклеазы FEN1 и скрининга низкомолекулярных ингибиторов, улучшив диагностику и целевые терапевтические исследования.
Текущие проблемы экспрессии включают в себя сложность и проблемы безопасности традиционных методов, а также высокую стоимость и специализированное оборудование, необходимое для существующих методов на основе флуоресценции.
Этот протокол устранил недостатки традиционного радиологического метода и дорогостоящих флуоресцентных методов, обеспечивая более безопасное, эффективное и простое в использовании решение для обнаружения.
Наша лаборатория сосредоточится на оптимизации высокопроизводительной скрининговой платформы для изучения in vivo применения и механизмов ингибиторов FEN1 в терапии рака.
[Инструктор] Для начала спроектируйте олигонуклеотидные цепи ДНК на основе специфической активности расщепления FEN1. Смешайте одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК в буфере для отжига. Добавьте 10 микролитров буфера для отжига и деионизированную воду, чтобы получился общий объем 50 микролитров. Затем нагрейте реакционную смесь до 100 градусов Цельсия в течение одной минуты в металлической ванне. Немедленно перенесите трубку на температуру 72 градуса Цельсия и выдерживайте в течение 10 минут. Затем выключите источник тепла и дайте раствору постепенно остыть до комнатной температуры, чтобы сформировать полный двухцепочечный субстрат ДНК. Для анализа активности нуклеазы FEN1 сначала соедините два микролитра субстрата ДНК с нуклеазой FEN1 в реакционном буфере. Инкубируйте реакционную смесь в металлической ванне при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Добавьте 20 микролитров в буфер 2X, чтобы остановить реакцию. Затем загрузите 20 микролитров прекращенного образца в заранее приготовленный 12% денатурирующий полиакриламидный гель. Электрофорировать гель при напряжении 100 вольт в течение 60 минут. После завершения визуализируйте результаты электрофореза с помощью системы флуоресцентной визуализации. С помощью пипетки перелейте два микролитра диметилсульфоксида в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте в пробирку два микролитра нуклеазы FEN1 и 10 микролитров реакционного буфера 2X и шесть микролитров деионизированной воды. Тщательно перемешайте раствор, после чего выдержите его на льду в течение 10 минут. После инкубации пипеткой пипетируйте два микролитра субстрата ДНК, чтобы получить конечный объем реакции 20 микролитров. Затем готовят рабочее разведение ингибитора нуклеазы FEN1 FEN1-IN-4 путем проведения двукратного серийного разведения из одномолярного раствора в диметилсульфоксиде. Пипеткой наберите по два микролитра нуклеазы FEN1 и разведенного ингибитора FEN1-IN-4 в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем пипетируйте 10 микролитров 2X реакционного буфера и четыре микролитра деионизированной воды. Аккуратно перемешайте и выдержите смесь на льду в течение 10 минут. Теперь добавьте в пробирку два микролитра субстрата ДНК, чтобы итоговый объем составил 20 микролитров. Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в металлической ванне в течение 15 минут. Затем завершите реакцию, добавив 20 микролитров терминирующего буфера. Прозрачная белковая полоса на уровне около 45 килодальтон подтвердила успешную очистку нуклеазы FEN1 от индуцированной экспрессии. Меченный флуоресцеином двухцепочечный субстрат ДНК появился при концентрации 80 килодальтон, что подтверждает успешный синтез по сравнению с одноцепочечной субстратом при концентрации 59 килодальтон. Нуклеаза FEN1 расщепляла 80-нуклеотидный двухцепочечный субстрат ДНК дозозависимым образом, при этом полное расщепление наблюдалось при 0,5 мкг на микролитр. Соединение FEN1-IN-4 значительно ингибировало расщепление двухцепочечного субстрата ДНК FEN1, о чем свидетельствует удержание 80-нуклеотидной полосы. FEN1-IN-4 снижал активность нуклеазы FEN1 в зависимости от концентрации, с половинной максимальной ингибирующей концентрацией 14,03 микромоляра.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен биохимический анализ на основе флуоресценции для оценки активности FEN1 (флап-эндонуклеазы 1) и содействия разработке низкомолекулярных ингибиторов. Работа направлена на преодоление ограничений, связанных с традиционными методами, и предлагает более безопасное и эффективное решение для детекции активности FEN1, имеющей значение для терапии рака.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Ферментативные анализы
- Биохимический скрининг
- Терапия рака
Теоретические основы
- FEN1 играет критически важную роль в метаболизме ДНК.
- Современные методы детекции сложны и дорогостоящи.
- Данное исследование направлено на решение этих проблем с помощью более удобного протокола.
Используемые методы
- Флуоресцентное детектирование активности нуклеазы FEN1
- Биохимический анализ с использованием двухцепочечных ДНК-субстратов
- Метод высокопроизводительного скрининга ингибиторов FEN1
Основные результаты
- Метод анализа успешно выявил расщепление двухцепочечной ДНК ферментом FEN1.
- Новое соединение FEN1-IN-4 подавляло нуклеазную активность концентрационно-зависимым образом.
- Значительное расщепление наблюдалось при определенных концентрациях, что подтверждает эффективность анализа.
Выводы
- В данном исследовании представлен практический метод оценки активности FEN1 и скрининга ингибиторов.
- Полученные результаты имеют важное значение для разработки методов таргетной терапии рака и биомолекулярных исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Флуоресцентное определение активности нуклеазы FEN1 отвечает критической потребности в более безопасных, масштабируемых и количественных методах анализа при поиске онкологических препаратов. Данный метод позволяет быстро оценить FEN1 как значимую мишень при раке и поддерживает высокопроизводительный скрининг низкомолекулярных ингибиторов, что напрямую влияет на отбор проектов на ранних стадиях и снижение механистических рисков. Его внедрение оптимизирует переход от валидации мишени к идентификации ведущих соединений в терапевтических разработках, сосредоточенных на репарации ДНК.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую изучать ферментативную функцию FEN1 в путях, значимых для патогенеза заболеваний.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки нуклеазной активности и эффектов ингибиторов.
- Обеспечивает прогностическую уверенность в FEN1 как в терапевтической мишени для онкологических портфелей препаратов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимый флуоресцентный анализ для надежного скрининга ингибиторов.
- Предоставляет количественные данные, подходящие для анализа зависимости «доза-ответ» и определения IC50.
- Снижает операционные риски по сравнению с протоколами на основе радиоизотопов.
- Способствует стандартизации и масштабируемости анализа для высокопроизводительных рабочих процессов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров путем установления связи между активностью FEN1 и фенотипами рака.
- Обеспечивает преемственность от биохимической валидации до доклинической оценки ингибиторов.
- Способствует продвижению кандидатов, нацеленных на FEN1, с учетом анализа рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный флуоресцентный анализ позволяет проводить валидацию мишени FEN1 и скрининг ингибиторов на стыке этапов первичного поиска и идентификации соединений-лидеров, что способствует бесшовной интеграции метода в процессы исследований и разработок в области онкологии.
- Биология открытий: Количественная оценка активности FEN1 для уточнения механизмов репарации ДНК и подтверждения взаимодействия с мишенью.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных количественных показателей эффективности и селективности ингибиторов.
- Аналитика: Возможность статистического сравнения активности фермента в различных условиях и при воздействии разных соединений.
- Трансляционные исследования: Связь биохимических результатов с моделями заболеваний посредством поддержки выбора кандидатов на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление универсальной платформы для текущих кампаний по поиску и скринингу соединений, связанных с FEN1.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогностической значимости FEN1 как мишени для терапии рака и устраняет неоднозначность в понимании механизмов.
- Операционная ценность: повышает безопасность, воспроизводимость и пропускную способность анализа при скрининге ингибиторов.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), а также эффективно распределять капитал при приоритизации мишеней восстановления ДНК.
- Влияние на портфель: способствует продвижению проектов с учетом рисков и стандартизации между программами в области поиска средств для лечения онкологических заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области энзимологии и разработки анализов на основе флуоресценции.
- Необходим доступ к системам флуоресцентной визуализации и оборудованию для гель-электрофореза.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения сопоставимости и воспроизводимости данных.
- Метод может быть адаптирован для различных ДНК-субстратов и библиотек ингибиторов для расширения области применения.
- Стабильность результатов зависит от тщательной оптимизации условий реакции.
