Полногеномный CRISPR-скрининг для выявления радиочувствительных и радиорезистентных генов

Это исследование сосредоточено на полногеномном скрининге CRISPR и лучевой терапии. Мы предоставляем протокол для просмотра радиочувствительных и радиорезистентных генов с помощью полногеномного скрининга CRISPR в клетках рака легких после облучения. Текущие экспериментальные проблемы включают в себя побочные эффекты, которые вызваны огромной сложностью генома и потенциальными трудностями в изучении лежащих в его основе механизмов. По сравнению с традиционными методами скрининга, CRISPR обеспечивает постоянную генетическую модификацию и демонстрирует превосходную точность, что делает его особенно ценным в функциональных геномных исследованиях и поиске мишеней. В будущем наша команда сосредоточится на изучении скрининга CRISPR in vivo, чтобы решить проблемы, оставленные этим исследованием, и мы будем стремиться оптимизировать технологию CRISPR.

[Рассказчик] Для начала отрегулируйте плотность адгезивных клеток до пяти умно-пятнадцати на 10 в степени пяти клеток на миллилитр. С помощью пипетки распределите по два миллилитра клеточной суспензии в каждую 3,5-сантиметровую чашку для культуры для лучевой обработки в разных дозах. Поместите посуду в инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и инкубируйте в течение ночи. Пронумеруйте каждую 3,5-сантиметровую посуду для культуры от одной до пяти, используя маркер. Используя источник излучения, подайте дозы облучения 2, 4, 6 и 8 грей соответственно на чашки со второй по пятую. Отрегулируйте плотность облучаемых клеток до одного умноженного на 10 в степени пяти клеток на миллилитр. Засейте по 10 микролитров на лунку, что соответствует 1000 клеток на 100 микролитров, в шестилуночные планшеты с тремя повторами на дозу облучения. Затем засейте 30 микролитров на лунку, что соответствует 3000 клеток на 100 микролитров, в 96-луночные планшеты с пятью повторами на дозу облучения. Теперь смешайте реагент CCK-8 со средой RPMI 1640 без FBS в соотношении один к девяти. Добавьте смесь в 96-луночную пластину и выдерживайте тарелку в темноте в течение одного часа. Затем используйте считыватель микропланшетов для измерения оптической плотности на 450 нанометрах. Чтобы начать процесс заражения, установите логарифмический градиент концентрации для лентивируса от нуля до 800 единиц на миллилитр. Добавьте соответствующий объем лентивируса к двум микролитрам полибрена на каждое блюдо и дайте ему уравновеситься при комнатной температуре в течение пяти минут. Медленно капните в каждую лунку смесь полибрена лентивируса. Отрегулируйте плотность родительских клеток до трех умножить на 10 в степени пяти клеток на миллилитр и ввести по одному миллилитру в каждую лунку 12-луночного планшета. Добавьте в лунки пуромицин в градиенте концентрации. Через 72 часа после заражения замените среду в каждой лунке полной средой, содержащей минимальную концентрацию пуромицина для уничтожения клеток. Рассчитайте кратность заражения для каждой лунки на основе выживших клеток. Отрегулируйте плотность адгезивных клеток в соотношении один умножить на 10 в степени семи клеток на миллилитр. Добавьте лентивирус при кратности инфекции, равной 0,3, в 30 микролитров на чашку полибрена и дайте ему уравновеситься при комнатной температуре в течение пяти минут. Медленно капните смесь лентивируса и полибрена в 15-сантиметровую чашку для культивирования. Хорошо перемешайте и инкубируйте его в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На второй день после заражения отсадите среду из чашки для культивирования и замените ее 15 мл полной среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Повторите ту же обработку неинфицированных родительских клеток в качестве отрицательного контроля и продолжайте культивирование в течение 72 часов. Теперь расщепляйте клетки из одной 15-сантиметровой чашки для культивирования с использованием 0,25% трипсина. Ресуспендируйте элементы в RPMI 1640 в полной среде с 10% PBS и подсчитайте количество клеток. После извлечения геномной ДНК для нулевого дня используйте УФ-спектрофотометр NanoDrop для измерения концентрации и чистоты ДНК. Введите соответствующую дозу облучения в клетки в группе лечения и оставьте клетки контрольной группы без лечения для нормального размножения. После 14 дней лечения расщепите клетки как лечебной, так и контрольной группы с использованием 0,25% трипсина. Ресуспендирование элементов в полной среде RPMI 1640 с 10% FBS. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS. После повторения этапа центрифугирования извлеките из гранулы геномную ДНК на 14-й день и определите концентрацию ДНК. Далее подготавливаем требуемые праймеры и разводим их до 10 микромоляров. После добавления компонентов для создания реакционной системы объемом 20 микролитров кратковременно центрифугируйте пробирку при 300 G в течение пяти секунд. Для электрофореза в агарозном геле приготовьте гель, снимите с него гребень и заполните резервуар для электрофореза достаточным буфером, чтобы покрыть гель. Добавьте загрузочный буфер к образцу ДНК и хорошо перемешайте. Наконец, загрузка смеси в лунки и начало электрофореза Образование колонии через 14 дней показало, что воздействие двух греев радиации значительно сократило количество выживших колоний по сравнению с нулевым баллом Грея. Анализ CCKA показал существенное снижение жизнеспособности клеток при двух Греях с дальнейшим снижением при более высоких дозах облучения. Лечение с повышением концентрации пуромицина в течение 72 часов показало, что один микромоляр является минимальной концентрацией, необходимой для уничтожения клеток А549. Валидация ПЦР показала отчетливые полосы на 231 паре оснований, подтвердив ожидаемую длину последовательностей sgRNA в библиотеке CRISPR. Анализ секвенирования показал, что примерно 60% прочтений были успешно картированы на референсный геном. Количество прочтений sgРНК соответствовало распределению Пуассона, что соответствовало теоретическим ожиданиям для скрининга в масштабе генома. Анализ PCA и тепловой карты показал высокую межгрупповую вариабельность и низкую межгрупповую вариабельность, подтверждая согласованность эксперимента. Онтологический анализ генов определил реакцию на повреждение ДНК как наиболее обогащенный путь среди 15 лучших результатов.