Изучение взаимодействий между миелоидными клетками и CAR-Т-клетками in vitro и in vivo
25 июля 2025 г.
Учитывая ограниченные модели ксенотрансплантатов, доступные для изучения взаимодействий между человеческим CART и миелоидными клетками, мы создали модели in vitro и in vivo , чтобы понять влияние макрофагов человека на клетки CART. Полученные данные потенциально могут быть обобщены для оценки роли макрофагов в микроокружении опухоли и тестирования иммунотерапии, направленной на макрофаги.
В нашем исследовании представлены упрощенные модели in vitro и in vivo, позволяющие понять влияние иммуносупрессивных макрофагов человека на противоопухолевую активность CA 19 в контексте мантийноклеточной лимфомы. Наиболее часто используемой моделью для изучения макрофагов и моноцитов человека in vivo является приживление гемопоэтических стволовых клеток у эрадикированных иммунодефицитных мышей. Приживление иммунодефицитных мышей с человеческими гемопоэтическими стволовыми клетками для изучения миелоидных клеток человека у мышей может быть трудоемким и дорогостоящим.
Эффективность приживления также может быть ограничена. Мы создали более упрощенные модели in vitro и in vivo для изучения взаимодействий между макрофагами человека, CAR-T-клетками и опухолевыми клетками. Его можно использовать и для тестирования других макрофагальных иммунотерапий.
Для начала центрифугируйте выделенные 10 миллионов классических моноцитов человека при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в питательных средах до конечной концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. Добавьте в суспензию человеческий рекомбинант GM-CSF до конечной концентрации 10 нанограмм на миллилитр и тщательно перемешайте.
Перенесите моноциты в колбу для культуры тканей T25 и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи дней. На седьмой день энергично пипетируйте клетки на льду каждые 10 минут, проверяя под микроскопом до тех пор, пока большинство макрофагов не отделятся. Переложите отделенные клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку со льдом.
Затем промойте клетки ледяным PBS, чтобы ослабить оставшиеся ячейки, и объедините их в коническую трубку. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток и центрифугируйте их при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите надосадочную жидкость, а затем промойте и повторно суспендируйте гранулу пятью миллилитрами ледяного PBS.
После повторного центрифугирования пробирки и аспирации надосадочной жидкости повторно суспендируйте конечную клеточную гранулу в ледяном PBS до достижения концентрации 20 миллионов клеток на миллилитр. Перелейте раствор в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и держите ее на льду. Далее переложите подготовленные 15 миллионов люциферазоположительных клеток JeKo в 15-миллилитровую коническую пробирку.
После центрифугирования клеток JeKo аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в ледяном PBS до концентрации 40 миллионов клеток на миллилитр. Теперь смешайте одинаковые объемы суспензии макрофагов и суспензии опухолевых клеток в свежей микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.
Добавьте такой же объем растворенной матрицы базальной мембраны и тщательно перемешайте на льду. В качестве контроля смешайте оставшиеся клетки JeKo с тем же объемом PBS в новой микроцентрифужной пробирке. Добавьте такой же объем растворенной матрицы базальной мембраны и перемешайте на льду.
После обезболивания мышей поместите их на нагретую сцену с носовыми конусами. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза мышей, чтобы предотвратить повреждение роговицы. Выбрейте правый бок каждой мыши, чтобы обнажить кожу.
Загрузите 100 микролитров смеси макрофагов JeKo в шприц объемом 0,5 миллилитра и удалите пузырьки воздуха. Осторожно приподнимите обнаженную кожу и введите иглу в приподнятый участок кожи, одновременно надавливая пальцем на участок. Медленно вводите клетки в подкожный слой и аккуратно извлекайте иглу.
Для оценки влияния иммуносупрессивных макрофагов in vivo прогрессирование опухолевой нагрузки отслеживали с помощью биолюминесцентной визуализации у мышей NSG, приживленных клетками JeKo отдельно или в комбинации с дифференцированными макрофагами. Присутствие дифференцированных макрофагов заметно ускоряло прогрессирование опухоли in vivo, о чем свидетельствует значительно большая опухолевая нагрузка у мышей, прижившихся с совместным приживлением, к 17-му дню по сравнению с одним JeKo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании созданы упрощенные модели in vitro и in vivo для изучения влияния иммуносупрессивных макрофагов человека на противоопухолевую активность CAR T-клеток при лимфоме из клеток мантийной зоны. Эти модели направлены на углубление понимания взаимодействий макрофагов в микроокружении опухоли и облегчение тестирования иммунотерапевтических средств, мишенью которых являются макрофаги.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Иммунология
- Онкология
Теоретическое обоснование
- Макрофаги человека играют критическую роль в микроокружении опухоли.
- Современные модели для изучения миелоидных клеток человека сложны и дорогостоящи.
- Понимание взаимодействий макрофагов с CAR T-клетками необходимо для совершенствования стратегий иммунотерапии.
- Существующие модели ксенографтов имеют ограничения по эффективности и практичности.
Цель исследования
- Разработка более эффективных моделей для изучения взаимодействий между макрофагами человека и CAR T-клетками.
- Оценка роли макрофагов в контексте лимфомы из клеток мантийной зоны.
- Облегчение тестирования методов иммунотерапии, направленных на макрофаги.
Используемые методы
- Создание моделей in vitro для изучения взаимодействий макрофагов.
- Разработка моделей in vivo с использованием упрощенных методов трансплантации.
- Оценка активности CAR T-клеток в присутствии макрофагов человека.
- Оценка потенциальных методов терапии, направленных на макрофаги.
Основные результаты
- Новые модели обеспечивают более доступный способ изучения макрофагов человека.
- Продемонстрированы взаимодействия между CAR T-клетками и макрофагами человека.
- Полученные результаты подтверждают потенциал иммунотерапии, направленной на макрофаги.
- Модели могут быть адаптированы для дальнейших исследований в области иммунологии опухолей.
Выводы
- Созданные модели расширяют понимание роли макрофагов при раке.
- Они предлагают практический подход для тестирования новых методов иммунотерапии.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для совершенствования стратегий лечения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Резистентность к терапии CAR T-клетками при гематологических злокачественных новообразованиях часто обусловлена иммуносупрессивными миелоидными клетками в микроокружении опухоли, что препятствует достижению стойкого клинического ответа. В данном исследовании представлены оптимизированные модели in vitro и in vivo для изучения механизмов влияния макрофагов человека на функцию CAR T-клеток, что позволяет напрямую оценить критический биологический риск в процессах разработки методов иммунотерапии. Эти модели позволяют трансляционным исследовательским группам снизить риски резистентности, опосредованной макрофагами, и обосновать разработку комбинированных стратегий, направленных на воздействие на макрофаги.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать подавление активности CAR T-клеток макрофагами в системах, релевантных для заболевания.
- Способствует снижению механистических рисков путем уточнения роли миелоидных клеток в развитии терапевтической резистентности.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для агентов, модулирующих функцию макрофагов, в портфелях препаратов для иммуноонкологии.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимые модели кокультивирования и ксенографтов для количественной оценки эффективности CAR-T-клеток в присутствии иммуносупрессивных макрофагов.
- Позволяет проводить стандартизированную оценку потенциальных методов терапии, направленных на макрофаги, для комбинированного скрининга.
- Поддерживает разработку методов анализа для измерения опухолевой нагрузки и взаимодействий иммунных клеток с использованием биолюминесценции и количественного определения клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приближает доклиническое моделирование к сложности микроокружения опухоли человека путем включения макрофагов человека в системы ксенографтов.
- Обеспечивает поиск трансляционных биомаркеров за счет отслеживания прогрессирования опухоли и иммунной модуляции in vivo.
- Поддерживает продвижение кандидатов для иммунотерапии с учетом рисков путем моделирования клинически значимых механизмов резистентности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эти модели служат связующим звеном между этапом первичного поиска и доклинической валидацией, позволяя проводить тестирование взаимодействий между макрофагами и CAR-T клетками, а также терапевтических вмешательств на основе выдвинутых гипотез.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку нулевой гипотезы об ингибировании CAR T-клеток макрофагами и выяснение механизмов этого процесса.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты для сравнения терапевтических условий в анализах с кокультивированием и в ксенотрансплантатах.
- Аналитика: предоставляет данные биолюминесценции и подсчета клеток для статистического анализа опухолевой нагрузки и функции иммунных клеток.
- Трансляционные исследования: моделирует сложность опухолевого микроокружения человека для доклинической оценки стратегий иммунотерапии.
- Повторное использование в масштабах предприятия: предлагает адаптируемые платформы для непрерывной оценки терапии, направленной на миелоидные клетки, и CAR T-клеточной терапии в рамках онкологических программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность эффективности иммунотерапии за счет моделирования ключевых механизмов резистентности.
- Операционная ценность: Оптимизирует доклинические рабочие процессы с помощью упрощенных, масштабируемых систем in vitro и in vivo.
- Стратегическая ценность: Служит основанием для принятия решений о целесообразности (go/no-go) проведения комбинированной иммунотерапии, направленной на микроокружение опухоли.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию кандидатов, направленных на преодоление макрофаг-опосредованной резистентности, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки изоляции, дифференцировки и совместного культивирования иммунных клеток человека.
- Необходим доступ к моделям иммунодефицитных мышей и инфраструктуре для биолюминесцентной визуализации при проведении исследований in vivo.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межкомандная стандартизация протоколов подготовки клеток, приживления и считывания результатов.
- Адаптация к другим моделям опухолей или типам иммунных клеток может потребовать оптимизации протокола.
- Ограничения включают эффективность приживления и необходимость тщательной интерпретации данных по человеко-мышиным ксенотрансплантатам.
![Динамическая визуализация Т-клеток рецептора химерного антигена с помощью [18F]Тетрафтороборатно-позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
