В Vivo 2-Фотон изображений кальция на уровне 2 / 3 от мышей

Чтобы понять сетевую динамику микросхем в неокортексе, необходимо одновременно регистрировать активность большого количества нейронов. In vivo. Визуализация кальция является единственным методом, позволяющим регистрировать активность плотной нейронной популяции с разрешением одной клетки.

Метод заключается в имплантации окна для визуализации черепа, введении флуоресцентного красителя кальция, который может быть поглощен большим количеством нейронов, и, наконец, регистрации активности нейронов с помощью покадровой визуализации кальция. Привет, я Пейман из лаборатории Карлоса Портера Кайо в отделении неврологии в Медицинской школе Дэвида Геффена в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. В предыдущих видеороликах наша лаборатория продемонстрировала процедуру выполнения трепанации черепа и фотонной визуализации кровотока у мышей.

Сегодня мы покажем вам процедуру выполнения визуализации кальция in vivo в фотонную у мышей. Итак, давайте перейдем к делу: Прежде чем начать. Раствор для инъекций красителя должен быть приготовлен

Сначала приготовьте флуоресцентный раствор индикатора кальция. Мы используем этиловые эфирные красители или сокращенно красители. Это красители, которые могут поглощаться клетками при внеклеточном введении, мы обычно используем зеленый орган BAFTA 1:00 AM или flu oh 4:00 AM в концентрации одного миллимолара.

Сначала готовим 20%-ный раствор onic F1 27. В ДМСО мы нагреваем раствор перед использованием каждый день до тех пор, пока он не станет прозрачным. Мы растворяем показатель кальция в 20%-ном F1 27 ДМСО в течение 15-20 минут до концентрации 10 миллимоляров.

Затем мы разбавляем раствор до одного миллимольяра в растворе, содержащем в миллимолярах 50 и ACL 2,5 KCL 10 куч, pH 7,4 и вихре еще на 10-20 минут. Мы добавляем 100 микромолярных рубцов серы 1 0 1 для селективной маркировки астроцитов, и чтобы визуализировать пипетку во время инъекции красителя, мы затем имплантируем краниальное окно над областью, которую нужно визуализировать. Общий подход к этой операции описан нами в ранее выпущенной видеостатье о работе, но для инъекций кальциевого красителя важны следующие модификации.

Меньший трепанация черепа диаметром два миллиметра выполняется над областью коры головного мозга, соблюдая крайнюю осторожность, чтобы не повредить нижележащую твердую мозговую оболочку. Покровное стекло закреплено на месте над краниотомией, но только частично закрывает краниотомию, оставляя небольшой зазор между краем трепанации черепа и стеклянным покровным стеклом, чтобы дать возможность пипетке войти в кору головного мозга наискось перед инъекцией. Вокруг трепанации черепа делается неглубокий колодец с зубным цементом.

Лунка для экспериментов по визуализации кальция должна простираться как можно дальше в ростральном направлении и быть достаточно мелкой, чтобы можно было ввести микропипетку для инъекции, мы фильтруем раствор с помощью центробежного фильтра 0,45 микрона непосредственно перед введением. Затем мышь переводится на столик микроскопа, а голова обездвиживается, как показано в нашем видео о визуализации кровотока. Затем мы вытягиваем стеклянные микроэлектродные пипетки до диаметра наконечника с сопротивлением от двух до четырех мегаом.

С помощью съемника пипетки смесь красителей для индикатора кальция загружается на стеклянную пипетку. С помощью микрошприца с микроманипулятором микропипетка аккуратно опускается на поверхность мозга с помощью объектива с четырьмя увеличениями, а затем более точно позиционируется. При объективе 40x подходящее место для инъекции выбирается таким образом, чтобы вышележащих кровеносных сосудов было мало или не было вовсе.

Чтобы скрыть изображение с помощью двухфотонной микроскопии, кончик микропипетки визуализируется и медленно продвигается в кору головного мозга на глубину 200 микрометров ниже твердой мозговой оболочки. Чтобы выполнить это с максимально возможной точностью, показания фокуса по оси Z объектива установлены на ноль. После того, как твердая мозговая оболочка визуализирована, микропипетка визуализируется, и считываются Z-фокусы, когда микропипетка опускается в мозг на 200 микрометров ниже твердой мозговой оболочки.

Затем смесь D впрыскивается под давлением 10 фунтов на квадратный дюйм в течение одной минуты. Используя пико-спритцер, мы обычно вводим от двух до четырех инъекций смеси кальциевого красителя AM, разделенной в пространстве примерно на 200-300 микрон. Такой подход к объемной загрузке, при котором впрыскиваются с небольшим перекрытием, гарантирует, что область размером 600 на 600 микрон будет адекватно окрашена для визуализации кальция.

Визуализация начинается через час после инъекции смеси красителя, чтобы дать возможность красителю диффундировать и впитаться нейронами. Двухфотонная визуализация in vivo выполняется с помощью специально изготовленного двухфотонного микроскопа с использованием хамелеонного сапфирового лазера, настроенного на 800-880 нанометров и Кембриджской технологии. Зеркальные изображения гальванометра получаются с помощью программного обеспечения для сканирования изображений, разработанного в Carl's Vida's.

Мощность лабораторного лазера обычно значительно ниже 70 милливатт на образце. Изображения всего поля получаются с помощью объектива Olympus 20 x 0,95 NA с частотой от 1,95 до 15,63 кадра в секунду, от пяти 12 на 2 56 пикселей до 2 56 на 64 пикселей. Линейное сканирование происходит с частотой 500 Гц во время визуализации.

Животных содержат под световым содержанием фтора, наркозом от 0,6 до 0,9%, а также содержат при температуре 37 градусов Цельсия с помощью аппарата Гарварда. Приборы для контроля температуры заботятся о том, чтобы частота дыхания животных была как можно ближе к 100 вдохам в минуту. Этот уровень использования анестезии является самым низким уровнем, который обездвиживает животное, но все же позволяет регистрировать спонтанную активность.

Итак, теперь давайте посмотрим на типичный эксперимент по визуализации кальция. Есть два, три нейрона: соматосенсорная бочкообразная кора от постнатального до восьми 10 мышей. Были окрашены в зеленый цвет органа BTA am и сфотографированы с объективом 20 x 0.95 NA.

Снимки делались каждые 0,512 секунды. Этот трехминутный фильм показывает совместную активацию больших частей нейронов этого окрашивания, происходящую от одного до двух раз в минуту. Мы только что показали вам, как выполнить визуализацию активности сети in vivo во втором третьем слое коры головного мозга.

Преимущество этого метода перед электрофизиологической регистрацией заключается в том, что он менее инвазивный и позволяет регистрировать активность в плотных нейронных сетях. При этом делать эту процедуру. Важно помнить о крайней осторожности при выполнении трепанации черепа, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку.

Даже небольшое субдуральное кровотечение сильно затруднит визуализацию. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.