Стандартизированная модульная сборка полицистронных оперонов с модульным клонированием (MoClo) с использованием инструментария In-Cloning

Я разработал методы, позволяющие модульно собирать ДНК от маленьких отдельных молекулярных частей до конструкций размера хромосом, а также перепрограммировать клетки с помощью этих искусственных хромосом. Одной из важных инноваций в этой области является разработка модульных наборов инструментов клонирования, позволяющих модульно собирать многогенные конструкции из библиотеки стандартизированных молекулярных частей. Модульные наборы инструментов для клонирования обычно предназначены для клонирования моноцистронных транскрипционных единиц.

Этот протокол демонстрирует обобщённый способ сборки полицистронных транскрипционных единиц с помощью инструмента для ин-клонирования. Эта стратегия клонирования полицистронного транскрипционного блока позволяет гибко использовать последовательности кодирования как в отдельном транскрипционном блоке, так и в полицистронных системах. Для начала выберите части уровня 0 для сборки в транскрипционный блок.

Они должны включать как минимум RBS, последовательность кодирования и терминатор. Выберите позицию, в которой транскрипционный блок будет собран в опероне. Исходя из выбранной позиции, выберите соответствующую акцепторную плазмиду и имитируйте сборку Golden Gate в SnapGene.

В реакции Золотых Ворот используйте фермент SAP1 для освобождения сайта связывания рибосом, кодирующей последовательности и терминатора из соответствующих плазмид, а затем разрезайте акцепторную плазмиду. Соберите сайт связывания рибосом, кодировальную последовательность и терминатор в плазмиду резного акцептора. Далее для реакции Золотых Ворот используйте пипетку, чтобы добавить 50 фемтомолей каждой желаемой вставки и 50 фемтомолей акцепторной плазмиды.

По одному микролитру 10x буфера ДНК-лигазы T4, T4-лигазы и SAP1 в реакционную трубку. Затем добавьте воду без нуклеаз, чтобы итоговый объём достиг 10 микролитров. Поставьте трубку в термоциклер.

Запустите 25 циклов при 37 градусах Цельсия в течение трёх минут, 16 градусов Цельсия — четыре минуты и 50 градусов Цельсия — 20 минут. Затем нагревайте ферменты при 80 градусах Цельсия на 20 минут. По желанию пипетить 0,5 микролитра SAP1 в реакцию GG и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.

Пипетте пять микролитров реакции смешивают в 50 микролитров химически компетентных клеток E.coli. Проведите термошоковую трансформацию, погрузив трубку в водяную ванну при 42 градусах Цельсия на 30 секунд, а затем поместите трубку на лёд на две минуты. Далее инкубировать клетки в одном миллилитре среды в течение часа для улучшения восстановления.

Пластинка 100 микролитров преобразования выходит на шнековую пластину LB, содержащую 100 микрограмм на миллилитр ампициллина. Инкубировать тарелку ночью при 37 градусах Цельсия. На следующий день выберите две белые колонии с помощью петли для инокуляции или наконечника пипетки.

Инокулятируйте каждый в пять миллилитров среды LB, содержащего 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в дрожащем инкубаторе со скоростью 250 оборотов в минуту. Выполните экстракция из клетчатой ткани согласно инструкциям производителя.

Переварить один микрограмм экстракции плазменной ДНК, добавив один микролитр 10-кратного буфера для пищеварения и один микролитр BBS1. Добавьте воду без нуклеаз, чтобы общий объём составил 10 микролитров, и инкубировать. Теперь загрузите переваренную плазмиду на гель 1%агарозы и проведите электрофорез при напряжении 100 вольт в течение 35 минут.

Затем сделайте изображение геля и подтвердите правильную сборку плазмиды. Чтобы собрать конструкцию уровня M, выберите единицы транскрипции первого уровня для сборки. Имитируйте сборку Golden Gate, освободив первый и второй транскрипционные блоки, а также конечный линкер с помощью фермента BBS1.

Одновременно разрезайте акцепторную плазмиду, затем соберите все три части в акцепторную плазмиду, чтобы сформировать полицистронный транскрипционный блок. Отрицательный контроль для плазмидной сборки первого уровня, в котором не было терминаторной части, не дало колоний, тогда как полная реакция дала 292 белых колонии и ни одной красной. Сборка многогенной конструкции без второй кассеты при 37 градусах Цельсия дала только две белые колонии, тогда как полная сборка — девять крупных и 435 маленьких колоний.

При 30 градусах Цельсия отрицательный контроль для многогенной сборки дал четыре белые колонии, а полная реакция — более 1 500 колоний. BSA1-дайджест акцепторной плазмиды PMA60 даёт ожидаемую однополосную зону при 5 500 парах оснований. BSA1 пищеварение плазмид из 24 колоний показало, что 23 из 24 показали правильную схему рестрикции двух полос примерно при 4 300 парах оснований и 1 700 парах оснований.

Флуоресцентная визуализация показала сильную зелёную и циановую флуоресценцию в колониях пластин с индуктором OC6, тогда как пластинки без индуктора показали минимальную или отсутствующую флуоресценцию.