Оптимизация выделения и очистки мезангиальных клеток клубочков мышей
7 марта 2025 г.
В этом исследовании был разработан оптимизированный протокол для выделения мышиных мезангиальных клеток (МЦ) и их культуры клеток ex vivo . Эти клетки могут быть пропущены несколько раз, заморожены, оживлены и культивированы без ущерба для роста клеток или экспрессии белка.
Одно из наших исследований посвящено почечной недостаточности, связанной с множественной миеломой. Чтобы поддержать наши исследования, мы разработали и в настоящее время оптимизировали протоколы для первичного культивирования мышиных мезангиальных клеток. Необходимое оборудование для проведения процедур легко доступно, а этапы процедуры просты.
Для получения клеток-мишеней требуется всего две-три недели. Этот метод облегчает исследования почек и поддерживает исследования, изучающие функцию мезангиальных клеток в моделях заболеваний, терапевтических разработках или исследованиях по передаче сигналов. Чтобы начать выделение мышиных мезангиальных клеток, или МЦ, от правильно усыпленного животного, с помощью ножниц и пинцета асептически удалите почки у мыши и поместите их в чашку Петри.
Промойте почки сбалансированным солевым раствором Эрла, затем с помощью пинцета аккуратно удалите соединительную ткань и капсулу почки. Вертикально разрежьте почку пополам с помощью скальпеля. Добавьте в чашку Петри три-четыре миллилитра раствора коллагеназы I и тщательно растрите ткань пластиковым клеточным пестиком.
Пипеткой наберите всю ткань и раствор из чашки Петри в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Промойте чашку Петри одним-двумя миллилитрами раствора коллагеназы I, чтобы обеспечить полный перенос тканей. Поместите трубку в шейкер при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 120 оборотов в минуту в течение 30 минут.
Затем добавьте в смесь равный объем стопового раствора или питательной среды. Пипеткой наберите раствор из пробирки центрифуги и пропустите его через сетчатый фильтр для ячеек толщиной 100 микрон. Соберите фильтрат в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.
Пропустите фильтрат через сетчатый фильтр с ячейками плотностью 40 микрон, сохранив только клетки на сетчатом фильтре. Многократно промойте ситечко питательной средой, чтобы максимизировать сбор клеток. Переложите собранные клетки из сетчатого фильтра в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.
Центрифугируйте суспензию при 600г в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования повторно суспендируйте клетки в чашке для клеточных культур в соответствии с желаемой плотностью клеток. Поместите посуду в клеточный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 95% воздуха и 5% углекислого газа.
Добавьте один-два миллилитра PBS вдоль внутреннего края чашки для культивирования, чтобы промыть клетки. С помощью пипетки удалите все PBS со дна чашки, затем добавьте 10 миллилитров питательной среды по одному вдоль внутреннего края чашки. Как только клетки достигнут 80% конфлюенции, обычно в течение 7-10 дней, дважды промойте клетки стерильным PBS.
Добавьте в чашку 0,25% раствор трипсина, чтобы трипсинизировать клетки. Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию. Когда большинство клеток демонстрируют округлую морфологию и отделяются от поверхности, прекратите трипсинизацию, добавив равный объем двух сред.
Центрифугируйте клетки при 600 г в течение пяти минут при комнатной температуре, затем повторно суспендируйте их в двух средах. Выделенные в этом исследовании ТК продемонстрировали значительно высокую экспрессию альфа-СМА, фибронектина и виментина. Иммунофлуоресцентное окрашивание очищенных и культивируемых ТК, проведенное после 10 дней культивирования в среде 2, показало, что более 95% клеток экспрессируют как альфа-СМА, так и виментин.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данная работа посвящена разработке оптимизированного протокола выделения и культивирования мезангиальных клеток (МК) мыши, которые имеют решающее значение для исследований почек. Метод позволяет осуществлять многократные пассирования, заморозку и размораживание клеток при сохранении их способности к росту и экспрессии белков.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Почечная недостаточность при множественной миеломе
- Функция мезангиальных клеток в моделях заболеваний почек
- Разработка терапевтических методов и исследования сигнальной трансдукции
Общие сведения
- Значимость мезангиальных клеток для здоровья почек
- Трудности в выделении и культивировании этих клеток
- Необходимость в надежных экспериментальных протоколах
Используемые методы
- Методы выделения с использованием коллагеназного переваривания
- Мышиная модель системы
- Культивирование клеток в контролируемых условиях
Основные результаты
- Высокая экспрессия alpha-SMA, фибронектина и виментина в культивируемых MCs
- Подтверждено успешное выделение и оптимальные условия роста
- Метод представляет собой надежный инструмент для дальнейших исследований почек
Выводы
- В исследовании продемонстрирован эффективный способ культивирования мезангиальных клеток (МК) мыши, что предоставляет ценные методики для изучения почек.
- Работа расширяет понимание роли мезангиальных клеток в патологиях почек.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективное выделение и очистка мезангиальных клеток (МК) почек мыши напрямую способствуют исследованиям в области нефрологии на ранних этапах и моделированию заболеваний. Данный оптимизированный протокол ускоряет получение МК высокой степени чистоты, что позволяет проводить надежную валидацию мишеней и изучение механизмов патобиологии почек. Этот подход сокращает время цикла и повышает воспроизводимость, увеличивая прогностическую достоверность при последующем поиске терапевтических средств.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает быстрое получение первичных культур МК для гипотезо-ориентированного исследования почечных путей.
- Поддерживает функциональную валидацию релевантных для заболевания мишеней в биологии клубочков.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет предоставления однородного клеточного материала для анализа путей.
- Повышает прогностическую достоверность моделей заболеваний почек на ранних стадиях.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные высокочистые MC для разработки анализов и скрининга соединений.
- Гарантирует воспроизводимый фенотип клеток с высоким уровнем экспрессии alpha-SMA и виментина.
- Обеспечивает масштабируемость и согласованность между партиями для рабочих процессов скрининга.
- Снижает вариабельность количественных показателей для достоверной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели MC in vitro в соответствие с патологиями почек, имеющими значение для заболевания, для проведения трансляционных исследований.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации в рамках нефрологических разработок.
- Позволяет принимать обоснованные решения о продвижении проекта с учетом рисков на основе достоверных клеточных данных.
- Предоставляет платформу для поиска биомаркеров в контексте гломерулярных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол рассматривает выделение MC как связующее звено между этапом первичного поиска и доклиническими исследованиями, что обеспечивает плавный переход от валидации мишени к идентификации ведущих соединений в программах изучения заболеваний почек.
- Открывательная биология: ускоряет проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в исследованиях гломерул.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых, готовых к анализу мезангиальных клеток (MC) для платформ количественного скрининга.
- Аналитика: позволяет измерять экспрессию белков (alpha-SMA, виментин) для сравнения различных состояний.
- Трансляционные исследования: связывает результаты, полученные in vitro, с доклиническими моделями почек для согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимый рабочий процесс выделения MC для различных проектов в области нефрологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и уменьшает механистическую неопределенность в исследованиях почечных мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует выделение MC, обеспечивая воспроизводимость и масштабируемость в рабочих процессах НИОКР.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в портфелях по нефрологии.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по заболеваниям почек.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области выделения первичных клеток и владение методами асептической техники.
- Необходим доступ к стандартному оборудованию для культивирования клеток и аналитическим приборам.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости фенотипа клеток и экспрессии белков.
- Метод применим к различным моделям мышей, но может потребовать оптимизации для других видов.
- Результат зависит от строгого соблюдения протоколов ферментативного переваривания и этапов очистки.
