Оптимизация выделения и очистки мезангиальных клеток клубочков мышей

Одно из наших исследований посвящено почечной недостаточности, связанной с множественной миеломой. Чтобы поддержать наши исследования, мы разработали и в настоящее время оптимизировали протоколы для первичного культивирования мышиных мезангиальных клеток. Необходимое оборудование для проведения процедур легко доступно, а этапы процедуры просты.

Для получения клеток-мишеней требуется всего две-три недели. Этот метод облегчает исследования почек и поддерживает исследования, изучающие функцию мезангиальных клеток в моделях заболеваний, терапевтических разработках или исследованиях по передаче сигналов. Чтобы начать выделение мышиных мезангиальных клеток, или МЦ, от правильно усыпленного животного, с помощью ножниц и пинцета асептически удалите почки у мыши и поместите их в чашку Петри.

Промойте почки сбалансированным солевым раствором Эрла, затем с помощью пинцета аккуратно удалите соединительную ткань и капсулу почки. Вертикально разрежьте почку пополам с помощью скальпеля. Добавьте в чашку Петри три-четыре миллилитра раствора коллагеназы I и тщательно растрите ткань пластиковым клеточным пестиком.

Пипеткой наберите всю ткань и раствор из чашки Петри в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Промойте чашку Петри одним-двумя миллилитрами раствора коллагеназы I, чтобы обеспечить полный перенос тканей. Поместите трубку в шейкер при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 120 оборотов в минуту в течение 30 минут.

Затем добавьте в смесь равный объем стопового раствора или питательной среды. Пипеткой наберите раствор из пробирки центрифуги и пропустите его через сетчатый фильтр для ячеек толщиной 100 микрон. Соберите фильтрат в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Пропустите фильтрат через сетчатый фильтр с ячейками плотностью 40 микрон, сохранив только клетки на сетчатом фильтре. Многократно промойте ситечко питательной средой, чтобы максимизировать сбор клеток. Переложите собранные клетки из сетчатого фильтра в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.

Центрифугируйте суспензию при 600г в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования повторно суспендируйте клетки в чашке для клеточных культур в соответствии с желаемой плотностью клеток. Поместите посуду в клеточный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 95% воздуха и 5% углекислого газа.

Добавьте один-два миллилитра PBS вдоль внутреннего края чашки для культивирования, чтобы промыть клетки. С помощью пипетки удалите все PBS со дна чашки, затем добавьте 10 миллилитров питательной среды по одному вдоль внутреннего края чашки. Как только клетки достигнут 80% конфлюенции, обычно в течение 7-10 дней, дважды промойте клетки стерильным PBS.

Добавьте в чашку 0,25% раствор трипсина, чтобы трипсинизировать клетки. Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию. Когда большинство клеток демонстрируют округлую морфологию и отделяются от поверхности, прекратите трипсинизацию, добавив равный объем двух сред.

Центрифугируйте клетки при 600 г в течение пяти минут при комнатной температуре, затем повторно суспендируйте их в двух средах. Выделенные в этом исследовании ТК продемонстрировали значительно высокую экспрессию альфа-СМА, фибронектина и виментина. Иммунофлуоресцентное окрашивание очищенных и культивируемых ТК, проведенное после 10 дней культивирования в среде 2, показало, что более 95% клеток экспрессируют как альфа-СМА, так и виментин.