Определение морфологии митохондрий в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии
3 июля 2025 г.
В этом исследовании мы описываем пошаговый протокол и выделяем ключевые детали для определения морфологических характеристик митохондрий в живых клетках, включая подготовку образцов, получение изображений и анализ данных. Этот метод обычно используется для изучения морфологии митохондрий для изучения различных состояний.
Наши исследования сосредоточены на фундаментальной нейрофармакологии. В частности, мы изучаем, как работают молекулы лекарств. Мы стремимся понять взаимосвязь между потенциальными лекарственными соединениями и функцией митохондрий при болезни Паркинсона.
В предыдущих исследованиях рассматривались давние проблемы анализа лабораторных клеток даже с учетом рекомендаций производителя. Чтобы решить эту проблему, мы описали подробный пошаговый протокол оценки морфологии митохондрий в лабораторных клетках. В нашем протоколе используется простое окрашивание митохондрий, флуоресцентная визуализация и программное обеспечение с открытым исходным кодом.
Это снижает стоимость, повышает доступность и делает его более простым в использовании по сравнению со сложными альтернативами, такими как электронная микроскопия. Для начала получите культуры клеток SH-SY5Y, выращенных в колбах, содержащих DMEM/F12, с добавлением 10% FBS. Отделите клетки на одну минуту с помощью 0,05% раствора трипсина.
Затем центрифугируйте клетки при 100 G в течение трех минут перед пассированием. Затем суспензируйте клетки SH-SY5Y в среде DMEM/F12 с добавлением 1% FBS. Затем высадите клетки на конфокальные чашки со стеклянным дном и выдержите их в течение ночи.
Для МПП+стимуляции замените питательную среду свежей средой с 1-метил-4-фенилпиридинием или без него на 24 часа. Для окрашивания MitoTracker разбавьте стоковый раствор MitoTracker предварительно подогретой средой DMEM/F12 до получения рабочей концентрации 50 наномоля. Храните раствор для окрашивания в защищенном от света месте на протяжении всей процедуры.
Удалите питательную среду из конфокальных посуд. Дважды промойте ячейки свежим DMEM/F12. Затем нанесите пипеткой один миллилитр рабочего раствора MitoTracker в чашку.
Выдерживать в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Теперь снимите рабочий раствор MitoTracker и дважды вымойте посуду с помощью DMEM/F12. После последнего мытья добавьте по одному миллилитру DMEM/F12 в каждую посуду.
Перед визуализацией инкубируйте в клеточном инкубаторе. Чтобы обеспечить предварительную балансировку конфокального микроскопа для получения изображений, под панелью сбора данных отрегулируйте параметры светового пути, установив длины волн возбуждения и излучения. Установите размер отверстия на 1,2 единицы, размер сканирования пикселей на 1024 на 1024, время задержки пикселей на 2,4 микросекунды со средним значением два.
Теперь используйте галогенный свет для фокусировки на клетках с помощью план-апохроматического объектива с 60-кратным увеличением и числовой апертурой 1,4, что сводит к минимуму фототоксичность. Отрегулируйте мощность лазера и высокое напряжение чуть ниже уровня насыщения. Затем установите коэффициент масштабирования на три и сделайте снимки.
Переместите интересующую область, чтобы сфокусироваться на других клетках под микроскопом. Затем делайте снимки без изменения настроек. Чтобы улучшить качество изображения перед двоичным преобразованием и скелетизацией, сначала откройте изображение.
Выделите область одной ячейки с помощью инструмента ROI. Теперь последовательно нажимаем на процесс, фильтры, функцию маски нерезкости для усиления резкости. Затем используйте технологию и увеличьте контрастность, чтобы уменьшить усиление шума.
Нажмите на «Процесс», «Фильтры» и «Медиана», чтобы удалить шум от соли и перца. Чтобы преобразовать изображение в двоичное, нажмите на процесс, а затем на двоичный и выберите опцию сделать двоичным. Скелетирование двоичного изображения путем нажатия кнопок Процесс, Двоичный файл и Скелетирование.
Затем сгруппируйте все пиксели скелета, выбрав «Анализировать», затем «Скелет» и «Анализ скелета 2D 3D». Упростите анализ, используя инструмент MiNA для вычисления девяти описательных параметров в скелетированном изображении. Интенсивность флуоресценции окрашивания митохондрий прогрессивно увеличивалась при концентрации красного CMXRos MitoTracker от 25 наномоляров до 200 наномоляров.
Но при 200 наномолярах наблюдалось существенное окрашивание цитоплазматическим фоном. Морфология митохондрий сохранялась лучше в среде DMEM/F12 по сравнению с PBS через час после окрашивания, хотя DMEM/F12 также демонстрировал более высокую фоновую флуоресценцию. Усреднение по двум кадрам значительно улучшило соотношение сигнал/шум при визуализации митохондрий по сравнению с режимом одиночного сканирования.
А увеличение времени задержки пикселей с 2,4 до 10,8 микросекунд привело к более ярким изображениям, но вызвало фотообесцвечивание. Увеличение высокого напряжения усиливало фоновый шум, в то время как увеличение мощности лазера приводило к фотообесцвечиванию. Инструмент MiNA обеспечил последовательные результаты скелетизации как для тусклых, так и для ярких изображений, что указывает на надежную сегментацию по различным интенсивностям флуоресценции, при этом яркое изображение демонстрирует в 5,5 раз более высокую интенсивность, чем тусклое.
Лечение MPP+ на 500 микромолях нарушило морфологию митохондрий в клетках SH-SY5Y по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, что привело к значительному уменьшению митохондриального следа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен подробный протокол оценки морфологии митохондрий в живых клетках SH-SY5Y, что актуально для фармакологических исследований, особенно при болезни Паркинсона. Метод делает акцент на доступности и снижении затрат за счет использования флуоресцентной визуализации с окрашиванием MitoTracker, что позволяет избежать применения таких сложных методов, как электронная микроскопия.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейрофармакология
- Митохондриальная функция
- Методы визуализации клеток
Теоретическая часть
- Сложности при анализе клеток в лаборатории сохраняются, несмотря на рекомендации производителей.
- Данное исследование решает эти проблемы, предлагая пошаговый протокол оценки морфологии митохондрий.
- Основное внимание уделяется снижению затрат и повышению доступности метода для исследователей.
Цель исследования
- Разработка воспроизводимого метода анализа морфологии митохондрий в живых клетках.
- Облегчение понимания взаимосвязи лекарственных соединений с функцией митохондрий при нейродегенеративных состояниях.
- Сравнение эффективности простых методов окрашивания с более сложными методами визуализации.
Используемые методы
- Основной используемой платформой является культура живых клеток.
- В качестве биологической модели для изучения митохондриального ответа на фармакологические агенты используются клетки нейробластомы SH-SY5Y.
- Получение изображений осуществляется с помощью флуоресцентной микроскопии, а для анализа данных используется программное обеспечение с открытым исходным кодом.
- Ключевые этапы включают открепление клеток, окрашивание MitoTracker и методы обработки изображений, такие как скелетизация.
Основные результаты
- Разработанный протокол позволяет улучшить визуализацию и анализ морфологии митохондрий.
- Было показано, что воздействие MPP+ значительно нарушает структуру митохондрий в обработанных клетках по сравнению с контрольной группой.
- Интенсивность флуоресценции и фоновый шум являются ключевыми факторами качества изображения.
Выводы
- В данном исследовании представлен надежный и экономически эффективный подход к визуализации морфологии митохондрий в живых нейронах.
- Метод позволяет углубить понимание динамики митохондрий при ответе на лекарственные препараты, особенно в моделях нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка морфологии митохондрий в живых клетках имеет решающее значение для механистического снижения рисков и валидации мишеней в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Данный протокол конфокальной микроскопии обеспечивает воспроизводимую и экономически эффективную оценку динамики митохондрий, повышая прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и в трансляционных рабочих процессах. Этот подход позволяет проводить надежное сравнение влияния соединений на структуру митохондрий, что напрямую влияет на решения по отбору и продвижению кандидатов в портфеле разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет исследовать динамику митохондрий в качестве функционального показателя для валидации мишени.
- Обеспечивает снижение механистических рисков путем количественной оценки морфологических изменений при фармакологическом стрессе.
- Предоставляет воспроизводимые количественные данные для повышения прогностической уверенности в связывании с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем с живыми клетками для последующего фенотипического скрининга модуляторов митохондрий.
- Стандартизация параметров визуализации и анализа для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости результатов анализа.
- Получение количественных морфологических данных, пригодных для оценки и отбора соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит показатели морфологии митохондрий в соответствие с клеточными моделями соответствующих заболеваний для обеспечения трансляционной преемственности.
- Обеспечивает продвижение с учетом рисков путем связывания результатов in vitro с доклиническими конечными точками.
- Способствует разработке биомаркеров за счет надежной количественной оценки морфологии.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол интегрируется в общий процесс исследований — от ранних механистических изысканий до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации, обеспечивая итеративную проверку гипотез и принятие решений на основе данных.
- Открывающая биология: количественная оценка морфологии митохондрий для выяснения эффектов сигнальных путей и биологических рисков.
- Скрининг: получение стандартизированных, воспроизводимых результатов визуализации для рабочих процессов скрининга соединений.
- Аналитика: предоставление надежных количественных морфологических параметров для статистического сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: установление связи между динамикой митохондрий in vitro и фенотипами, имеющими значение для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: масштабируемая и адаптируемая платформа для многократного использования в различных клеточных моделях и проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях митохондрий.
- Операционная ценность: стандартизирует визуализацию и анализ живых клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и эффективно управлять портфелем с точки зрения затрат капитала.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по изучению нейродегенеративных заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области визуализации живых клеток и эксплуатации конфокального микроскопа.
- Необходим доступ к флуоресцентным микроскопам и программному обеспечению для анализа изображений с открытым исходным кодом.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров окрашивания, получения изображений и анализа.
- Методика адаптируема к различным клеточным моделям при условии оптимизации протокола для каждой системы.
- Необходима тщательная калибровка для минимизации фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.
