Определение морфологии митохондрий в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии
3 июля 2025 г.
В этом исследовании мы описываем пошаговый протокол и выделяем ключевые детали для определения морфологических характеристик митохондрий в живых клетках, включая подготовку образцов, получение изображений и анализ данных. Этот метод обычно используется для изучения морфологии митохондрий для изучения различных состояний.
Наши исследования сосредоточены на фундаментальной нейрофармакологии. В частности, мы изучаем, как работают молекулы лекарств. Мы стремимся понять взаимосвязь между потенциальными лекарственными соединениями и функцией митохондрий при болезни Паркинсона.
В предыдущих исследованиях рассматривались давние проблемы анализа лабораторных клеток даже с учетом рекомендаций производителя. Чтобы решить эту проблему, мы описали подробный пошаговый протокол оценки морфологии митохондрий в лабораторных клетках. В нашем протоколе используется простое окрашивание митохондрий, флуоресцентная визуализация и программное обеспечение с открытым исходным кодом.
Это снижает стоимость, повышает доступность и делает его более простым в использовании по сравнению со сложными альтернативами, такими как электронная микроскопия. Для начала получите культуры клеток SH-SY5Y, выращенных в колбах, содержащих DMEM/F12, с добавлением 10% FBS. Отделите клетки на одну минуту с помощью 0,05% раствора трипсина.
Затем центрифугируйте клетки при 100 G в течение трех минут перед пассированием. Затем суспензируйте клетки SH-SY5Y в среде DMEM/F12 с добавлением 1% FBS. Затем высадите клетки на конфокальные чашки со стеклянным дном и выдержите их в течение ночи.
Для МПП+стимуляции замените питательную среду свежей средой с 1-метил-4-фенилпиридинием или без него на 24 часа. Для окрашивания MitoTracker разбавьте стоковый раствор MitoTracker предварительно подогретой средой DMEM/F12 до получения рабочей концентрации 50 наномоля. Храните раствор для окрашивания в защищенном от света месте на протяжении всей процедуры.
Удалите питательную среду из конфокальных посуд. Дважды промойте ячейки свежим DMEM/F12. Затем нанесите пипеткой один миллилитр рабочего раствора MitoTracker в чашку.
Выдерживать в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Теперь снимите рабочий раствор MitoTracker и дважды вымойте посуду с помощью DMEM/F12. После последнего мытья добавьте по одному миллилитру DMEM/F12 в каждую посуду.
Перед визуализацией инкубируйте в клеточном инкубаторе. Чтобы обеспечить предварительную балансировку конфокального микроскопа для получения изображений, под панелью сбора данных отрегулируйте параметры светового пути, установив длины волн возбуждения и излучения. Установите размер отверстия на 1,2 единицы, размер сканирования пикселей на 1024 на 1024, время задержки пикселей на 2,4 микросекунды со средним значением два.
Теперь используйте галогенный свет для фокусировки на клетках с помощью план-апохроматического объектива с 60-кратным увеличением и числовой апертурой 1,4, что сводит к минимуму фототоксичность. Отрегулируйте мощность лазера и высокое напряжение чуть ниже уровня насыщения. Затем установите коэффициент масштабирования на три и сделайте снимки.
Переместите интересующую область, чтобы сфокусироваться на других клетках под микроскопом. Затем делайте снимки без изменения настроек. Чтобы улучшить качество изображения перед двоичным преобразованием и скелетизацией, сначала откройте изображение.
Выделите область одной ячейки с помощью инструмента ROI. Теперь последовательно нажимаем на процесс, фильтры, функцию маски нерезкости для усиления резкости. Затем используйте технологию и увеличьте контрастность, чтобы уменьшить усиление шума.
Нажмите на «Процесс», «Фильтры» и «Медиана», чтобы удалить шум от соли и перца. Чтобы преобразовать изображение в двоичное, нажмите на процесс, а затем на двоичный и выберите опцию сделать двоичным. Скелетирование двоичного изображения путем нажатия кнопок Процесс, Двоичный файл и Скелетирование.
Затем сгруппируйте все пиксели скелета, выбрав «Анализировать», затем «Скелет» и «Анализ скелета 2D 3D». Упростите анализ, используя инструмент MiNA для вычисления девяти описательных параметров в скелетированном изображении. Интенсивность флуоресценции окрашивания митохондрий прогрессивно увеличивалась при концентрации красного CMXRos MitoTracker от 25 наномоляров до 200 наномоляров.
Но при 200 наномолярах наблюдалось существенное окрашивание цитоплазматическим фоном. Морфология митохондрий сохранялась лучше в среде DMEM/F12 по сравнению с PBS через час после окрашивания, хотя DMEM/F12 также демонстрировал более высокую фоновую флуоресценцию. Усреднение по двум кадрам значительно улучшило соотношение сигнал/шум при визуализации митохондрий по сравнению с режимом одиночного сканирования.
А увеличение времени задержки пикселей с 2,4 до 10,8 микросекунд привело к более ярким изображениям, но вызвало фотообесцвечивание. Увеличение высокого напряжения усиливало фоновый шум, в то время как увеличение мощности лазера приводило к фотообесцвечиванию. Инструмент MiNA обеспечил последовательные результаты скелетизации как для тусклых, так и для ярких изображений, что указывает на надежную сегментацию по различным интенсивностям флуоресценции, при этом яркое изображение демонстрирует в 5,5 раз более высокую интенсивность, чем тусклое.
Лечение MPP+ на 500 микромолях нарушило морфологию митохондрий в клетках SH-SY5Y по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, что привело к значительному уменьшению митохондриального следа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование представляет детальный протокол для оценки морфологии митохондрий в живых клетках SH-SY5Y, что актуально для фармакологических исследований, особенно при болезни Паркинсона. Метод акцентирует на доступности и низких затратах за счет использования флуоресцентной визуализации с окрашиванием MitoTracker, избегая сложных методов, таких как электронная микроскопия.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейрофармакология
- Функция митохондрий
- Методы клеточной визуализации
Предпосылки
- Проблемы анализа лабораторных клеток сохраняются несмотря на рекомендации производителей.
- Это исследование устраняет их, излагая пошаговый протокол для оценки морфологии митохондрий.
- Основное внимание уделяется снижению затрат и повышению доступности для исследователей.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый метод анализа морфологии митохондрий в живых клетках.
- Способствовать пониманию связей лекарственных соединений с функцией митохондрий в нейродегенеративных состояниях.
- Сравнить эффективность простых методов окрашивания с более сложными методами визуализации.
Используемые методы
- Основной платформой является культура живых клеток.
- Используются нейробластоматные клетки SH-SY5Y как биологическая модель для исследования реакции митохондрий на фармакологические агенты.
- Получение изображений включает флуоресцентную микроскопию и открытое программное обеспечение для анализа данных.
- Ключевые этапы включают отделение клеток, окрашивание MitoTracker и техники обработки изображений, такие как скелетизация.
Основные результаты
- Разработанный протокол позволяет улучшить визуализацию и анализ морфологии митохондрий.
- Было показано, что лечение MPP+ значительно нарушает структуру митохондрий в обработанных клетках по сравнению с контролем.
- Интенсивность флуоресценции и фоновый шум являются ключевыми факторами качества изображения.
Выводы
- Это исследование устанавливает надежный и экономичный подход к визуализации морфологии митохондрий в живых нейронах.
- Метод улучшает понимание динамических свойств митохондрий в ответе на лекарства, особенно в моделях нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial morphology in live cells is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurodegenerative disease research. This confocal microscopy protocol enables reproducible, cost-effective evaluation of mitochondrial dynamics, supporting predictive confidence in early discovery and translational workflows. The approach facilitates robust comparison of compound effects on mitochondrial structure, directly informing portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial dynamics as a functional readout for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying morphological changes under pharmacological stress.
- Provides reproducible, quantitative data to inform predictive confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream phenotypic screening of mitochondrial modulators.
- Standardizes imaging and analysis parameters to ensure assay reproducibility and comparability.
- Generates quantitative morphological outputs suitable for compound evaluation and triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology metrics with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by linking in vitro findings to preclinical endpoints.
- Facilitates biomarker development through robust morphological quantification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven decision-making.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial morphology to clarify pathway effects and biological risk.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs for compound screening workflows.
- Analytics: Provides robust, quantitative morphological parameters for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse cell models and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Needs access to fluorescence microscopes and open-source image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis parameters.
- Adaptable to various cell models with protocol optimization for each system.
- Careful calibration is necessary to minimize photobleaching and background fluorescence.
