Митохондриальный препарат из микроглии для анализа гликанов

В целом, наше исследование сосредоточено на определении механистической роли сахаров, или гликанов, и на том, как мы можем использовать эти клеточные и субклеточные пути гликозилирования при старении, а также при заболеваниях мозга. В настоящее время существует пробел в знаниях о роли, а также модуляции субклеточных гликанов в различных патофизиологиях заболеваний, включая острые и хронические расстройства мозга, такие как инсульт и болезнь Альцгеймера. Этот протокол и наше исследование направлены на расширение знаний о роли гликанов в нейроиммунных взаимодействиях и о том, как эта информация может быть использована для разработки лучших и эффективных методов лечения центральной нервной системы.

[Рассказчик] Для начала получите микроглиальные клетки BV-2, полученные от мышей C57BL/6. Поддерживайте их в среде DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% FBS, 1% пенициллина стрептомицина и 1% заменимых аминокислот. Выращивайте клетки в колбах T175 до тех пор, пока они не достигнут 70–80% конфлюенции. Отсасывайте среду из колбы. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре питательной среды. С помощью трипана синего посчитайте ячейки. Центрифугируйте клетки в двухмиллилитровой микроцентрифужной пробирке при давлении 500 G в течение пяти минут. Осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 800 микролитров реагента для выделения митохондрий А и делайте вихрь на средней скорости в течение пяти секунд. Затем инкубируйте трубку на льду ровно две минуты. Добавьте 10 микролитров реагента для выделения митохондрий В и сделайте вихрь на максимальной скорости в течение пяти секунд. Инкубируйте на льду в течение пяти минут, совершая вихри на максимальной скорости каждую минуту. Теперь добавьте 800 микролитров реагента для выделения митохондрий С и переверните пробирку для перемешивания. И центрифугировать при 700 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую пробирку и центрифугируйте при температуре 3000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую цитозольную часть, в новую пробирку. Гранула содержит изолированные митохондрии. Добавьте в гранулу 500 микролитров реагента для выделения митохондрий C и центрифугируйте при 12 000 G в течение пяти минут. Ресуспендировать изолированные митохондрии в 50 микролитрах буфера для изоляции белка. Оставьте суспензию на льду на 20 минут. Отсадите и дозируйте три раза, а затем оставьте на льду на 20 минут, переворачивая перед использованием. Если раствор не полностью растворился, добавьте еще 50 микролитров буфера и бассейн в той же пробирке. Центрифугируйте при 13 000 G в течение 10 минут. После восстановления и заморозки надосадочной жидкости просушите с помощью вакуумного концентратора. Для обнаружения высвобождающихся гликанов суспендируйте высушенные и связанные гликаны в 50 микролитрах воды класса LCMS. Пипеткой внесите пять микролитров ресуспендированных митохондриальных гликанов в образец на тефлоновом микролуночном предметном стекле. Ионизировать и детектировать N-гликаны в режиме отрицательной ионизации с помощью растворителя электроспрея, состоящего из 60% ацетонитрила и одной миллимолярной уксусной кислоты со скоростью потока два микролитра в минуту и напряжением 3,2 киловольта. Подключите IR-MALDESI к масс-спектрометру HRAM, установленному на разрешающую способность 240 000 по полной ширине в полумаксимуме при отношении массы к заряду 200 для анализа отношения массы к заряду между 502 000 в режиме отрицательной ионизации. Вручную определите N-связанные гликаны путем поиска моноизотопных масс. Подтвердите распределения изотопов с использованием разноса массы и заряда для определения дважды и трижды заряженных ионов с минимальным порогом потока ионов 1000 ионов в секунду. Преобразуйте исходные масс-спектры для отношения массы к заряду в нейтральные моноизотопные массы. Затем загрузите моноизотопные массы в онлайн-инструмент для прогнозирования структуры олигосахаридов, чтобы определить потенциальные составы гликанов. Подтверждайте аннотации с помощью экспериментально подобранной базы данных глико. Убедитесь, что каждая идентификация находится в пределах 2,5 частей на миллион по массе, содержит ядро и связанную гликановую структуру и исключает пентозу, 3-дезокси-d-манно-окт-2-улосоновую кислоту или моносахариды уроновой кислоты. Концентрации митохондриальных белков, полученные из шести независимых препаратов, не показали существенных вариаций, что подтверждает высокую воспроизводимость. Западный анализ крови показал экспрессию CoxIV только в митохондриальных фракциях и GAPDH только в цитоплазматических фракциях, подтверждая чистоту митохондриальных изолятов и отсутствие немитохондриальной контаминации. Различные сиатилированные, фосфорилированные и сульфатированные N-гликановые структуры были обнаружены в митохондриальных экстрактах с использованием IR-MALDESI. Тестирование на соответствие высоким квадратам подтвердило обнаружение N-связанных гликанов с одним и двумя аддуктами хлора, подтвердив обнаружение этих гликанов с помощью IR-MALDESI.