Идентификация видов микобактерий методом ДНК-микрочипов

[Рассказчик] Данное исследование посвящено молекулярной диагностике в клинической микробиологии. По сравнению с традиционными методами обнаружения, метод чипа ДНК-микрочипа для идентификации видов микобактерий является высокочувствительным, специфичным и быстрым, что может оказать важную помощь в ранней диагностике клинических пациентов. В настоящее время методы быстрой идентификации нетуберкулезных микобактерий ограничены во многих лабораториях, что напрямую влияет на клиническую диагностику и лечение пациентов. Для начала установите температуру водяной бани постоянной температуры на 50 градусов Цельсия и разогрейте ее. Чтобы приготовить чипы, добавьте 200 микролитров дистиллированной воды на дно коробки для гибридизации чипов с помощью генного микрочипа. Поместите кронштейн между двумя позиционирующими столбцами внутри коробки. Осторожно поместите чип лицевой стороной вверх на скобу и закройте его защитным накладкой так, чтобы четыре бобышки были обращены вниз, следя за тем, чтобы конец защитного стекла совпадал с этикеткой на конце чипа. Затем подготовьте пробирки для центрифуги объемом 200 микролитров или восемь полосок в зависимости от количества образцов и правильно промаркируйте их. Нагрейте гибридизационный буфер из комплекта при температуре 50 градусов Цельсия до полного расплавления. После тщательного перемешивания быстро центрифугируйте его в микроцентрифуге. Аликвотируйте девять микролитров гибридизационного буфера в каждую подготовленную пробирку или полоску. Добавьте шесть микролитров соответствующего продукта ПЦР в каждую пробирку, сделав итоговый объем 15 микролитров на реакционную смесь. Нагрейте смесь для реакции гибридизации до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы денатурировать ее с помощью инструмента для ПЦР или водяной бани. После лечения денатурацией немедленно погрузите смесь в смесь ледяной воды и выдерживайте в течение трех минут. Снимите смесь для реакции гибридизации с ледяной бани и перемешайте ее, дважды пипетируя вверх и вниз. Когда не останется осадка белого флокулянта, добавьте 13,5 микролитров реакционной смеси через загрузочное отверстие покровного стекла. Быстро накройте и запечатайте коробку для гибридизации и запишите номер чипа, положение микрочипа и номер образца. Теперь поместите герметичные гибридизационные боксы горизонтально в водяную баню постоянной температуры, предварительно нагретую до 50 градусов Цельсия. Поместив внутрь все коробки, запустите таймер на 120 минут. После завершения реакции гибридизации выньте коробки для гибридизации горизонтально, разберите их и извлеките чипсы. Немедленно поместите чипсы на решетку для слайдов внутрь контейнера, наполненного раствором для промывки чипсов I, который был отрегулирован до комнатной температуры, и промойте их при 80-100 об/мин на шейкере с постоянной температурой в течение трех минут при комнатной температуре. Снова промойте чипсы раствором для промывки чипсов II на шейкере, установленном на 80–100 об/мин, в течение трех минут при комнатной температуре. Теперь поместите чипсы в центрифугу и крутите при 100 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Включите сканер. А затем откройте соответствующий софт. Нажмите кнопку «Управление лазером», чтобы дать ему предварительно нагреться в течение 10 минут. Ввод информации, связанной с выборкой, в программное обеспечение. После того как сканер завершит предварительный нагрев, нажмите кнопку «Извлечь». Положите высушенную стружку на небольшой кусок скобки. Аккуратно и горизонтально вставьте чип в отсек сканера и нажмите кнопку «Загрузить». Теперь введите номер микрочипа в программное обеспечение и нажмите для выбора области обнаружения микрочипа от 1 до 4. Нажмите кнопку Select Sample (Выбрать образец), чтобы выбрать соответствующие образцы для каждого микрочипа. Затем нажмите «Начать обнаружение», чтобы начать сканирование чипов. Результаты сканирования будут отображены на экране и автоматически сохранены. Используйте страницу запроса данных для выполнения запросов данных и операций печати. После выполнения всех операций выключите лазер, выйдите из программного обеспечения и, наконец, выключите сканер. Достоверность экспериментальных результатов подтверждена контролем качества, при котором положительный контроль дает результат выявления комплекса микобактерий туберкулеза, а отрицательный контроль не дает микобактерий. Интерпретация тестовых образцов начинается со случаев, когда все зонды, в том числе и с наибольшим значением сигнала, отрицательные, в результате чего сообщается об отсутствии микобактерий. В образцах, где только зонд комплекса микобактерий туберкулеза показывает сильный сигнал, результат идентифицируется как положительный для этой группы видов. Если зонд, соответствующий Mycobacterium avium, является единственным с сильным сигналом, образец идентифицируется как положительный на Mycobacterium avium. Если только внутренний контрольный щуп положительный, а все остальные отрицательные, результат сообщается как неопределенный, что указывает на наличие вида микобактерий, не охваченных набором для обнаружения.