Внутриклеточная фосфофлоу-цитометрия ксенотрансплантатов пациентов с острым миелоидным лейкозом

Наше исследование направлено на то, чтобы понять, как острый миелоидный лейкоз развивает устойчивость к одобренным методам лечения. На основе гипотезы о том, что метаболические факторы играют ключевую роль. Конечная цель состоит в том, чтобы определить стратегию, которая сможет эффективно преодолеть это сопротивление. Проточная цитометрия, широко используемая в исследованиях лейкемии, идеально подходит для анализа суспензионных клеток, таких как лейкозные клетки. Его адаптивность делает его мощным инструментом для молекулярного механизма данных. Основной экспериментальной задачей в исследованиях ОМЛ является разработка оптимального in vivo протокола молекулярного оживления, который представляет собой клетку для точного моделирования, понимания механизма, лежащего в основе резистентности к терапевтическим препаратам.

[Рассказчик] Для начала согните колено мыши и используйте недоминирующую руку для обездвиживания ноги, чтобы обнажить суставную поверхность бедренной кости, где находится сторона прокола. Поместите большой палец на большеберцовую кость, указательный палец на бедренную кость, а средний палец на внешнюю сторону костей, чтобы стабилизировать их. Сохраняя иммобилизацию, продезинфицируйте область колена изопропиловым спиртом, чтобы отодвинуть оставшиеся волоски и улучшить визуализацию костной структуры. С помощью первого сухого шприца 25 калибра поместите иглу в середину бедренного сустава и осторожно поверните ее, чтобы создать отверстие в бедренной суставной поверхности без приложения силы. Как только игла войдет в костный мозг, постепенно извлекайте шприц, вращая его. Вставьте второй промытый шприц в отверстие, созданное первой иглой. Подайте вакуум на второй шприц, вставленный в бедренную кость, при этом осторожно вращая и постепенно извлекая его. Переведите извлеченный костный мозг, промыв содержимое шприца в охлажденную микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 микролитров PBS. Держите образец на льду. Слегка надавите на место прокола с помощью тампона изопропанола в течение 30 секунд, чтобы остановить кровотечение. Центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Используя систему вакуумной аспирации, аккуратно отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 200 микролитров на образец раствора для окрашивания флуоресцентных клеток. Разводят один к 100 в PBS для маркировки мертвых клеток. Аккуратно повторно подвесьте клетки с помощью пипетки. Затем инкубируйте клетки на льду в течение 10 минут, защищенных от света. Через 10 минут центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной системы, добавьте 100 микролитров на образец антитела HCD 45 Brilliant ultraviolet 395, разведенного до одного к 100 в PBS, содержащем 2% эмбриональной бычьей сыворотки, для мечения гемопоэтических клеток человека. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 минут, обеспечивая их защиту от света. Центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной системы. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре 1,6% формальдегида в растворе PBS. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут, в защищенном от света месте. Через 10 минут центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной системы. Теперь добавьте один миллилитр 100% метанола, предварительно охлажденного до минус 20 градусов по Цельсию, прямо в два миллитра. Инкубируйте образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 30 минут в защищенном от света месте. Центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. С помощью вакуумной системы аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в каждый образец по 50 микролитров смешанного раствора антител или смешанного раствора контроля изотипа. Аккуратно повторно суспензируйте клетки с помощью пипетки, инкубируйте все образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, обеспечивая их защиту от света. Затем центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросив надосадочную жидкость, промойте клетки 1000 микролитрами PBS, аккуратно повторно суспендируя их пипеткой. Снова центрифугируйте ячейки при температуре 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости проведите повторную промывку с использованием 1000 микролитров PBS и аккуратно повторно суспензируйте клетки с помощью пипетки, прежде чем снова центрифугировать клетки при четырех градусах Цельсия. После отсасывания надосадочной жидкости окончательные образцы повторно суспендируют в 200 микролитрах PBS. На этом рисунке показан рабочий процесс, стратегия стробирования и нормализация внутриклеточных сигналов фосфопротеинов в клетках костного мозга у мышей с острым миелоидным лейкозом, полученных от пациентов с ксенотрансплантатом, получавших терапию на основе венетоклакса в течение 15 дней. Стратегия гейтирования успешно идентифицировала жизнеспособные клетки острого миелоидного лейкоза человека или ОМЛ на основе профилей прямого и бокового рассеяния и положительного результата CD45, что позволило провести последовательный анализ во всех группах лечения. Лечение венетоклаксом-5-азацитидином и CDZ уридином привело к повышенному фосфорилированию STAT5 и RPS6 в клетках ОМЛ, что свидетельствует об активации путей выживания, связанных с резистентностью. Интересно, что когда мышей лечили гилтеритинибом, лечение не привело к значительному снижению фосфорилирования белков пути FLT3, что указывает на то, что передача сигналов сохранялась, несмотря на таргетную терапию. Фосфорилированный STAT5 и фосфорилированный RPS6 показали наиболее сильное увеличение корреляции уровней экспрессии после терапии на основе венетоклакса, что указывает на коактивацию этих путей.