В пробирке Посев H5N1-специфичных Т-клеток уток и выявление иммунных реакций методом внутриклеточного окрашивания цитокинов

Мы стремимся разработать протокол in vitro для культивирования H5N1-специфичных Т-клеток уток и количественно оценить секрецию ИФН-γ с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинами. Недавние исследования подчеркивают важность птичьего Т-клеточного иммунитета в борьбе с вирусными инфекциями, но стандартизированные методы культивирования для уток все еще отсутствуют. Мы успешно культивировали H5N1-специфичные Т-клетки уток и разработали новый проточный сегментарный протокол ICS для обнаружения экспрессии ИФН-γ утками. Мы будем изучать антиген-специфические Т-клеточные ответы у других видов домашней птицы и разрабатывать иммунологические инструменты для оценки вакцин и противовирусных исследований.

[Рассказчик] Для начала выделите мононуклеарные клетки периферической крови памяти, или PBMC, от уток, которые были инфицированы вирусом H5N1 28 днями ранее, и отрегулируйте концентрацию выделенных клеток до 3 умножить на 10 в степени 6 клеток на миллилитр. Теперь выдайте по 1 миллилитру среды в каждую лунку 48-луночного планшета. Затем добавьте вирус птичьего гриппа H5N1 в PBMC при кратности инфекции 5 для совместной инфекции клеток и инкубируйте ко-культуру в течение одного часа при 37° Цельсия. Каждые 15 минут осторожно встряхивайте тарелку рукой, чтобы обеспечить равномерное распределение. Через час после заражения дважды промойте PBMC PBS, чтобы удалить несвязанные вирусные частицы. Повторно суспендируйте промытые PBMC в 1 миллилитре питательной среды для Т-клеток и инкубируйте суспензию при 37° Цельсия в течение пяти часов. Затем центрифугируйте клетки при 440 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулированные антигенпрезентирующие клетки, или АПК, в 100 микролитрах питательной среды для Т-клеток и добавьте ресуспендированные АПК к эффекторным клеткам в соотношении 1:5. Теперь инкубируйте сокультуру в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% при температуре 37° Цельсия в течение 14 дней. Каждые два дня удаляйте половину надосадочной жидкости с помощью пипетки. Выбросьте использованную среду, содержащую клетки, и добавьте такой же объем свежей Т-клеточной среды. На седьмой день наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении. Обработайте отдельный набор APC памяти PBS и используйте их в качестве нестимулированной контрольной группы. На седьмой день извлеките культуры H5N1-специфичных Т-клеток из инкубатора и соберите все клетки из каждой лунки в пробирку. Теперь добавьте инкубированные APC и брефелдин А в разведении 1:1000 к эффекторным клеткам и соинкубируйте в течение шести часов в инкубаторе при температуре 39° Цельсия. Затем переложите ячейки в чистую центрифужную пробирку и вращайте ее при давлении 440 x g в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в клетки 100 микролитров коктейля антител, содержащего мышиное антитело к утиному CD8, и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при температуре 4° Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре PBS. Центрифугируйте клетки при 400 x g в течение пяти минут при 4° Цельсия. После удаления надосадочной жидкости добавьте конъюгированное FITC-конъюгированное антитело IgG2b к мышам и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при температуре 4° Цельсия. Затем снова вращайте ячейки при 400 x g в течение пяти минут при 4° Цельсия. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах фиксирующего буфера и инкубируйте смесь в течение 20-25 минут в темноте при температуре 4° Цельсия. Затем дважды промойте клетки 1 миллилитром 1x пермеабилизационного буфера, как было показано ранее. Затем отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах буфера для пермеабилизации. Инкубируйте клетки с мышиным антителом к ИФН-γ, разведенным в соотношении от 1 до 10, в течение 30 минут в темноте при 4° Цельсия. После промывки клеток добавьте 100 микролитров ПЭ-конъюгированного козьего антитела против мышей IgG3, разведенного в соотношении 1 к 250, и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при температуре 4° Цельсия. Наконец, проанализируйте обработанные образцы с помощью программного обеспечения FlowJo. После совместного культивирования с антигенпрезентирующими клетками вирусспецифические Т-клетки продемонстрировали кластерный рост, что свидетельствует об успешной пролиферации. Мечение сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина выявило множественные пики деления клеток в стимулированных образцах, что подтвердило обширную пролиферацию Т-клеток памяти уток. Доля CD4+ и CD8+ Т-клеток была значительно выше в культурах, стимулированных H5N1, чем в нестимулированной контрольной группе через 14 дней. Пролиферирующие Т-клетки на седьмой день культивирования показали повышенную экспрессию цитотокс-ассоциированных генов, таких как гранзим А и интерферон-гамма, что указывает на цитотоксический фенотип. Проточная цитометрия показала значительное увеличение доли интерферон-гамма-положительных клеток в популяциях CD8 с высоким и CD8 низким уровнем Т после стимуляции антигеном.