Эффективные методы комплексного отбора проб доступных тканей у взрослых Xenopus

Эта работа направлена на создание воспроизводимого метода быстрого сбора данных о желудочке сердца Xenopus, артериальном стволе, левой доле печени, желчном пузыре, легких, поджелудочной железе, селезенке, гортани, пищеводе, желудке, кишечнике, яичках, жировом теле, яйцеводе, парных почках, седалищном сплетении, коже, тимусе и всем глазе менее чем за один час. Экспериментальной задачей является оптимизация свежести тканей. По этой причине протокол был разработан таким образом, чтобы его можно было завершить менее чем за один час. Отдавая приоритет свежести тканей, эти ткани можно использовать для проведения высококачественных биохимических анализов, таких как протеомика, при этом сводя к минимуму количество используемых животных. В будущем мы напишем протокол для тканей, к которым сложнее получить доступ, таких как мозг, мышцы и кости.

[Инструктор] Для начала расположите усыпленную лягушку для процедуры вскрытия и прикрепите конечности. С помощью ножниц для рассечения разрежьте кожу по средней линии, а затем сбоку создайте два кожных лоскута. С помощью щипцов захватите белую линию и оттяните ее от целомической полости. Аккуратно разрежьте мускулатуру по направлению к голове и создайте два створки стенки полости. Уменьшите коракоидные кости, чтобы получить лучший доступ к сердцу. Растяните перикард, пропертите его и очистите назад, чтобы обнажить три камеры сердца. Теперь обрежьте оракулы в том месте, где они встречаются с желудочком и артериальным стволом. С помощью щипцов захватите верхушку желудочка и разрежьте его чуть ниже места соединения с артериальным стволом, оставив край. Наблюдая за разветвлением артериального ствола, натяните ствол и разрежьте стволы аорты сразу после мест, где они разделяются на дуги. Далее возьмитесь за губу левой доли печени и осторожно поднимите ее, чтобы обнажить печеночные и пузырные протоки. Возьмите образцы нижних двух третей левой доли ниже этих насадок. Определив желчный пузырь, захватите и оттяните его от правой доли печени и разорвите его прикрепление. Затем возьмитесь за верхушку легкого и натяните ее. Разрежьте легкое на границе, где оно переходит в бронх. Удалите бронх из гортани. Для удаления яичников сместите доли яичников в соответствующие стороны, чтобы визуализировать места прикрепления вентрально к почкам. С помощью ножниц удалите яичники близко к почкам, не причинив им вреда. Затем осмотрите переднюю долю печени, также известную как срединная доля, и понаблюдайте за ее соединением с двенадцатиперстной кишкой через брыжейку. Используйте ножницы для иридэктомии, чтобы разорвать брыжеечную и гепатодуоденальную связки. Оставшаяся мясистая масса – это поджелудочная железа и общий желчный проток. Перерезать соединение поджелудочной железы и общего желчного протока с передней долей печени, оставив край. Обхватите живот зубчатыми щипцами и один конец поджелудочной железы тканевыми щипцами. Под увеличением аккуратно отведите поджелудочную железу от живота. Затем определите селезенку и возьмите ее образец, разрезав ее прикрепление к брюшине. Возьмитесь за гортань за ее нижний конец и начните поднимать ее из полости, разрезая любые перитонеальные прикрепления по мере их встречи. Поскольку гортань приподнята, используйте изогнутые ножницы для иридэктомии, чтобы аккуратно отделить и разрезать ткань пищевода от гортани. Затем потяните гортань вниз и отрежьте ее от ротовой полости, отрезав оставшиеся видимые насадки. Обратите внимание на искривление желудка, которое отличает его от пищевода, и на сужение привратника, отмечающее начало кишечника. Разрежьте пищеварительный канал прямо перед искривлением желудка, чтобы отделить его от пищевода. Откройте рот и найдите общее отверстие евстахиевых труб на его крыше. Держа рот открытым, потяните за пищевод, чтобы наблюдать за его прикреплением. Затем разрежьте пищевод из щечной полости чуть ниже евстахиева отверстия. Затем удалите пищевод. Теперь возьмитесь за живот и разрежьте его в месте привратного сужения, где он соединяется с двенадцатиперстной кишкой. Натяните толстую кишку и разрежьте ее как можно ближе к клоаке. Удалите кишечник, попутно отсекая все видимые перитонеальные прикрепления. Если лягушка самец, определите семенники и удалите одно из них с помощью иридэктомических ножниц, убедившись, что почка остается неповрежденной. Раздразните толстые тела и расположите их на боку, чтобы обнажить брюшинное прикрепление возле почки. Возьмитесь за основание толстого тела и отрежьте его от брюшины, оставив запас. Чтобы удалить мочевой пузырь, разрежьте как можно ближе к клоаке. Если лягушка самка или имеет видимый рудиментарный яйцевод, возьмитесь за нижний конец яйцевода и оттяните его от клоаки. Разрежьте яйцевод рядом с клоакой, а затем вытащите его из целомической полости, разорвав любые прикрепления брюшины. С помощью щипцов захватите забрюшинные парные почки и разрежьте брюшину у их основания. Поднимите почки из полости, разорвав все перитонеальные прикрепления. Далее захватите пучок нервов в области седалищного сплетения щипцами и перережьте нервы в местах их выхода из целомической полости. Поднимите нервный пучок и разрежьте его снова в месте соединения с позвоночным столбом. Теперь снимите булавки и переверните животное на брюшную сторону. Снова приколите конечности и выберите одну заднюю конечность для забора, приколов ее ногу. Иссеките миндалевидный участок кожи над икроножной и большеберцовой областью. Возьмитесь за спинную кожу и сделайте боковой разрез вокруг живота. Чтобы создать непрерывный круговой разрез. Снимите штифты, закрепите ноги в одной руке и используйте щипцы с крысиными зубами, чтобы захватить переднюю спинную кожу. Снимите шкуру с животного, с силой натянув спинную кожу на голову и руки. Чтобы взять образец тимуса, определите жировую массу, покрывающую челюстной сустав, и разрежьте задний край образования, где оно срастается с розовой мышечной тканью. С помощью ножниц для иридэктомии отрежьте массу из кости, обнажив скопления меланофоров, если таковые имеются. Затем обрежьте ткань, чтобы удалить любые мышцы или хрящи. Далее репите животное и выберите глаз. Вставьте изогнутые ножницы для иридэктомии в глазницу и аккуратно разрежьте вокруг изгиба глаза, чтобы освободить мышечные прикрепления. Наконец, сдвиньте ножницы вглубь орбиты и разрежьте зрительный нерв за глазом. Вытащите глаз из глазницы и отрежьте все оставшиеся мышцы. Следуя этой процедуре, все основные органы были извлечены, промыты и обрезаны в течение одного часа после эвтаназии.