Воспроизводимое производство SPOT в качестве высокопроизводительной платформы для культивирования на основе скаффолдов

Наши исследования сосредоточены на разработке высокопроизводительных платформ с поддержкой скаффолдов для надежных, воспроизводимых оргономических культур, полученных от пациентов, чтобы улучшить рабочий процесс скрининга лекарств и помочь в расширенном моделировании заболеваний.

Автоматизированные манипуляторы жидкостей, гидрогелевые платформы на основе скаффолдов, технологии «орган на чипе» и анализы отдельных клеток, такие как проточная цитометрия и CYTOPs, — вот некоторые из доступных в настоящее время технологий.

Текущие проблемы включают сохранение целостности гидрогеля, преодоление гелевого мениска для визуализации в реальном времени и обеспечение равномерного распределения клеток в долгосрочных анализах на основе органоидов.

Наш протокол обеспечивает стабильную загрузку гидрогеля с помощью скаффолда, сводит к минимуму проблемы с мениском, поддерживает долгосрочное культивирование органоидов и легко интегрируется с автоматизированными манипуляторами жидкостей и системой визуализации с высоким содержанием жидкости.

Больше всего нас радует использование наших платформ моделирования заболеваний для изучения механизмов прогрессирования заболевания при раке и развитии ожирения.

[Инструктор] Для начала возьмите каркас с рисунком ПММА для 96 или 384 SPOT. Обрежьте лишнюю бумагу вокруг синей области леса, оставив белое поле в пять миллиметров по периметру. Убедитесь, что полученный лист имеет размеры примерно 760 миллиметров на 1 300 миллиметров. Чтобы подготовить строительные леса 96 SPOT к сборке, уложите кусок полиэтиленовой пленки поверх жесткой акриловой опоры. Поместите эту опору, покрытую пленкой, на рабочую поверхность и положите подмости поверх полиэтиленовой пленки. Выровняйте край линейки между первыми двумя рядами строительных лесов, чтобы избежать следования в лунках. Поместите копирующее колесо в нижнюю часть лесов и прокатите его вверх к верху, ориентируясь на линейку. Для скаффолда 384 SPOT не выполняйте перфорацию. Затем уложите строительные леса шероховатой стороной вверх на плиту PDMS, следя за тем, чтобы ряды шли горизонтально. Используйте линию грунтовки, чтобы определить, какая сторона шероховатая, затем разгладьте строительные леса на плите, чтобы удалить складки или пузыри. Снимите защитный слой с негравированной стороны двустороннего скотча. Слегка застегните ленту посередине и совместите два средних столбика ленты с лесами. Теперь прижмите середину ленты к каркасу, чтобы обеспечить выравнивание. Разгладьте ленту наружу от центра, чтобы равномерно закрепить ее. С помощью пинцета аккуратно приподнимите строительные леса из плиты PDMS. Храните плиту впрок. Чтобы прикрепить строительные леса к ленте второго колодца, переверните подмости так, чтобы гладкая незаклеенная сторона была обращена вверх на верстак. Снимите средний защитный слой с гравированной стороны второй ленты, чтобы обнажить две центральные колонки. Слегка застегните середину второй ленты и выровняйте ее по средним столбикам подмостков, затем прижмите центр ленты, чтобы зафиксировать ее на месте. Если используется гравированная лента, удалите оставшиеся защитные слои, прилегающие к открытому центру. Разгладьте ленту, начиная с середины и двигаясь наружу. Чтобы прикрепить каркас к бездонной плите, снимите защитный слой. Совместите строительные леса под бездонной пластиной с крышкой. После выравнивания прижмите его середину к пластине. Если вы используете гравированную ленту, удалите соседние слои и разгладьте скаффолд на плите наружу от центра. Чтобы прикрепить каркас к поликарбонатной пленке, с помощью пинцета осторожно ослабьте защитный слой с одной стороны поликарбонатной пленки, затем медленно снимите защитный слой, не вызывая никаких углублений в пленке. Повторите процесс для второй стороны, затем отложите пленку в сторону на верстаке. Снимите слой защитной ленты с нижней части плиты и прижмите поликарбонатную пленку к каркасу от центра к краям. Затем плотно прижмите поликарбонатную пленку к каркасу, чтобы убедиться, что у каждой лунки есть определенная граница. С помощью прецизионного ножа аккуратно срежьте излишки материала с нижней части тарелки. После полной сборки поместите пластину 96 SPOT в прозрачный закрывающийся пластиковый пакет и вынесите его за пределы шкафа для биобезопасности. Поместите жесткую акриловую опору под пластину и зажмите обе в противоположных углах. Храните тарелку в чистом сухом месте до дальнейшего использования. Утечки или замены среды не наблюдалось при заполнении чередующихся скважин в пластине 384 SPOT флуоресцеином и PBS в течение 30-дневного испытательного периода, что подтверждает эффективность барьера из ПММА в поддержании изоляции от скважины к скважине. Органоиды опухоли поджелудочной железы, экспрессирующие GFP, посеянные в 96 планшетов SPOT, оставались жизнеспособными и постепенно расширялись с нулевого дня до 12-го дня культивирования. На 12-й день органоиды, выращенные в SPOT, продемонстрировали сильную экспрессию цитокератина 19 и Zonula Occludens-1, а также наличие внутренних структур просвета. Субоптимальные и оптимальные результаты посева тканей в 384 планшетах SPOT были визуально различимы по определению краев и равномерности распределения клеток. Равномерный посев был достигнут на всех пластинах 96 SPOT и 384 SPOT с помощью автоматизированного манипулятора жидкостей.