Расщепленный гибридизационный зонд с использованием флуоресцентного светящегося аптамера ДНК в качестве сигнального репортера для анализа последовательно-специфичных нуклеиновых кислот

Мы разрабатываем новые типы флуоресцентных гибридизационных зондов для последовательно-специфического анализа нуклеиновых кислот. В последнее время инструменты анализа гибридизации расширились за счет анализов, использующих преимущества систем CRISPR-Cas. В настоящее время для анализа мишеней нуклеиновых кислот чаще всего используются современные гибридизационные зонды, такие как TaqMan, и молекулярные маячковые зонды.

Точное обнаружение однонуклеотидных замен и мишеней нуклеиновых кислот по-прежнему остается практически сложной задачей. Наш протокол обеспечивает необходимый уровень активности клеток, обеспечивая при этом считывание флуоресцентного сигнала без меток. Для начала спроектируем последовательности двух немодифицированных олигонуклеотидных цепей ДНК, составляющих SLAS.

Используйте фрагмент, содержащий нуклеотиды, для получения от 6 до 39 DAP-10-42. Преобразуйте стебель 1, состоящий из нуклеотидов с 1 по 8 и с 36 по 42, в стержень 1, удалив выпуклый тимин в положении 5, укоротив стебель до четырех пар оснований и добавив концевую пару оснований цитозин-гуанин. Включите нуклеотиды с 9 по 29 в одну цепь SLAS и нуклеотиды от 30 до 35 в другую.

Удлините три простые концевые последовательности фрагмента нуклеотидами с 9 по 29, добавив дезокси GGTCAT. Затем удлините последовательность из пяти простых концевых элементов от 30 до 35 с помощью дезокси TGACC, чтобы сформировать стержень 2 из шести пар оснований. Теперь продлите прайм ствола 1 на обеих цепях с помощью дезокси-линкеров TT и последовательностей ДНК, комплементарных мишени нуклеиновой кислоты.

В результате получаются последовательности нитей SLAS-U и SLAS-S, составляющих зонд. Сделайте SLAS-S комплементарным для области с 7–10 нуклеотидами. Это включает в себя сайт однонуклеотидной замены.

Затем убедитесь, что мишенное связывающее плечо SLAS-U является комплементарным к 15-25-нуклеотидному фрагменту, прилегающему к области SLAS-S. Оцените температуру плавления дуплексов целевого связывания с помощью веб-сервера UNAFold. Перейдите на вкладку INAMelt.

Перейдите в раздел «Приложения» и выберите «Гибридизация плавления в двух состояниях». Введите взаимодействующие последовательности в порядке от пяти простых до трех простых чисел в левом и правом полях. Затем отрегулируйте температуру анализа до 22 градусов Цельсия и введите концентрации одновалентных и двухвалентных катионов до 20 миллимолярных и 25 миллимолярных ионов соответственно.

Отрегулируйте концентрации взаимодействующих последовательностей в соответствующем поле. Нажмите кнопку «Отправить» и просмотрите значения изменения энергии Гиббса, энтальпы Y, энтропии и температуры плавления для соответствующих дуплексов. Убедитесь, что температура плавления идеально согласованных мишеней и связующих рук мишеней SLAS-S и SLAS-U выше температуры пробы, 22 градуса Цельсия.

Убедитесь, что дуплекс между SLAS-S и несовпадающей мишенью дает температуру плавления ниже температуры анализа для поддержания специфичности. При необходимости отрегулируйте длину рычагов привязки мишени в соответствии с этими условиями. Получите готовые олигонуклеотидные нити SLAS-U и SLAS-S у коммерческого поставщика ДНК или синтезируйте их самостоятельно с помощью автоматизированного синтезатора ДНК.

Приготовьте стоковые растворы Auramine O, SLAS-S, SLAS-U и буфер для анализа. Приготовьте мастер-смесь, содержащую все компоненты анализа, кроме мишени. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, в последний пятый-шестой объем мастер-микса.

Затем сделайте вихрь и раскрутите мастер-микс. Раздайте по 50 микролитров в каждую пробирку с образцом. Затем пометьте один образец как пустой без цели, а другой как положительный контроль.

Добавьте 10 микролитров образца, содержащего мишень, в пробирку, содержащую мастер-смесь, чтобы получить образец объемом 60 микролитров. Для заготовки добавьте 10 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Затем пипеткой в положительную контрольную пробирку впрыскивается 10 микролитров синтетического олигонуклеотида ДНК, содержащего целевую последовательность.

Кратковременно перемешайте все образцы в центрифуге с помощью микроцентрифуги. Затем инкубируйте пробирки при температуре 22 градуса Цельсия в течение 10-60 минут. Измеряйте флуоресценцию на 540 нанометрах при возбуждении на глубине 475 нанометров с помощью флуоресцентного спектрофотометра.

SLAS был разработан для нацеливания на определенный фрагмент гена NANOGP8. Мишень M была полностью комплементарна цепи SLAS-S, в то время как мишень MM имела позицию цитозинового нуклеотида 1, 423, что вносило несоответствие с SLAS-S. При добавлении полностью комплементарной мишени М флуоресценция неуклонно увеличивалась и стабилизировалась через 45-50 минут.

Тем не менее, четкий сигнал был обнаружен в течение 10 минут с отношением сигнал/холостой 10. SLAS показал высокий флуоресцентный сигнал для полностью согласованных целей, но не для несовпадающих целей или холостых частей. Выход флуоресценции линейно увеличивается с концентрацией мишени до 500 наномоляров, что позволяет количественно оценить и определить пределы обнаружения. Амплифицированные образцы ПЦР показали различные уровни сигнала, и только Образец 2 превысил пороговое значение флуоресценции 2.

На основании калибровочной кривой концентрация ампликона NANOGP8 в образце 2 была оценена на уровне 124+или 13 наномоляров. Флуоресцентное детектирование сигнала SLAS было одинаковым как на настольном спектрофотометре, так и на портативном флуориметре. Отношение сигнал/холостой сигнал/холостой выше 20 также визуально наблюдалось с помощью ультрафиолетового света.