Мультимодальная система визуализации для улучшения фенотипирования живых клеток рака молочной железы без меток

В настоящее время мы представляем мультимодальную визуализацию с использованием конфокальной рамановской микроспектроскопии и томографической фазовой микроскопии для быстрого и несмещенного морфохимического фенотипирования клеток рака молочной железы человека в их естественной физиологической среде. Сочетание рамановской микроспектроскопии и томографической фазовой микроскопии позволяет получать безмаркерную визуализацию в физиологических условиях, предоставляя биохимическую и морфологическую информацию о клетках и устраняя ограничения традиционных методов возмущения, таких как флуоресцентное мечение или химическая фиксация. Полученные нами результаты демонстрируют высокий потенциал реализации мультимодального подхода в обеспечении морфохимического фенотипирования клеток рака молочной железы. Более того, его универсальность, воспроизводимость и неинвазивность сделали его многообещающим инструментом для широкого спектра биомедицинских приложений, от фундаментальных исследований клеточной биологии до диагностики.

Мы стремимся создать атлас оптических биомаркеров для неинвазивного контроля качества эмбрионов, выявления клеточного старения и скрининга лекарств в органоидных моделях для продвижения регенеративной медицины и исследований заболеваний.

[Инструктор] Для начала поместите образец клетки рака молочной железы человека MDA-MB-231 в инкубатор на сцене. Добавьте воду для цели погружения в воду. Включите автоматический погружной питатель для подачи воды к линзе объектива. Регулярно проверяйте уровень воды, чтобы избежать испарения и обеспечить стабильные условия визуализации на протяжении всех измерений. Теперь включите лазер накачки и отрегулируйте его выходную мощность, чтобы достичь мощности лазера в 75 милливатт в плоскости образца. Откройте программное обеспечение для управления микроскопом Micro-Manager. В настройках конфигурации выберите BF и нажмите кнопку live в левой части окна программного обеспечения. Выберите нужную отдельную ячейку, затем нажмите кнопку «Стоп», чтобы завершить визуализацию яркого поля. Откройте программное обеспечение для управления ПЗС-камерой. В настройках эксперимента установите время экспозиции 1,5 секунды. Нажмите «Выполнить» на панели инструментов эксперимента и включите лазерный луч. Затем отрегулируйте положение Z, чтобы максимизировать количество сигналов в области отпечатков пальцев от 600 до 1800 обратных сантиметров, затем выключите лазер. Нажмите кнопку «Стоп» на панели инструментов эксперимента и выйдите из программы. Запустите процесс сбора данных с помощью скрипта MATLAB, который автоматически управляет рамановскими каналами в многомерных измерениях и сохраняет данные. Установите поле зрения на квадрат 50 на 50 микрометров с разрешением 40 на 40 пикселей, каждый пиксель должен покрывать квадрат размером 1,25 на 1,25 микрометра. Установите время экспозиции для каждого спектра комбинационного рассеяния света равным 1,5 секундам и запустите скрипт MATLAB. Для постобработки гиперспектральных карт комбинационного рассеяния света запустите веб-инструмент RamApp. Импортируйте гиперспектральные данные, нажав на кнопку «Создать» на вкладке «Мои анализы», и загрузите файл .mat, содержащий переменные пространственных и спектральных данных, а также переменную по оси X. Чтобы обрезать спектр, в меню обрезки и поворота выберите спектральную обрезку. Определите нижнюю и верхнюю границы области комбинационного сдвига как 600 и 1800 обратных сантиметров соответственно. Чтобы сделать поправку на космические лучи, перейдите в раздел Denoising, нажмите despike, выберите Z-score в качестве метода и установите пороговое значение на восемь. Отметьте параметры «Использовать первую разность» и «Исправить пики», затем нажмите «Выполнить», чтобы применить коррекцию. Чтобы удалить шум с карт, нажмите «Сгладить карту», выберите фильтр медианы, установите размер квадрата равным трем пикселям, затем нажмите «Выполнить». Чтобы сгладить спектр каждого пикселя, выберите фильтр Савистского-Голея. Установите длину окна фильтра равным семи и порядок полиномов равным двум, затем нажмите кнопку «Выполнить». Чтобы вычесть средний фоновый сигнал, откройте оптическое удаление подложки и нажмите кнопку Идентифицировать подложку. Установите k-means в качестве метода с двумя кластерами. Затем нажмите на «Дополнительные параметры». Выберите морфологическую очистку, чтобы удалить небольшие капли с переднего плана, затем нажмите кнопку «Выполнить». Чтобы удалить средний фоновый сигнал, нажмите «Удалить подложку», затем выберите глобальное среднее или среднее метода центральных 95% значений и нажмите «Запустить». Чтобы скорректировать базовую флуоресценцию, откройте панель базовой линии, нажмите на правильную базовую линию, выберите адаптивную плавность PLS, затем установите лямбду на 5 миллионов и нажмите «Выполнить». Для нормализации каждой рамановской гиперспектральной карты перейдите в раздел Разное, выберите Нормализовать, выберите метод Фробениуса и нажмите кнопку Выполнить. Чтобы создать изображение в ложном цвете, показывающее субклеточное распределение, на панели изображений нажмите на символ открытия меню под изображением интенсивности, затем нажмите «Редактировать изображение». На панели редактирования выберите однополосный и определите спектральный диапазон. Теперь выберите двойной цвет на цветовой карте, затем определите цвет, порог интенсивности и непрозрачность, прежде чем нажать кнопку «Подтвердить». Для загрузки спектра по одной точке выберите интересующий вас пиксель, затем на панели легенды спектра нажмите кнопку Загрузить спектр. Наконец, чтобы экспортировать спектры переднего плана и подложки, перейдите к легенде спектра, затем нажмите «Загрузить спектр» для разделов переднего плана и подложки. Капните каплю дистиллированной воды на линзу объектива микроскопа. Расположите образец на предметном столике микроскопа, затем отрегулируйте положение образца, чтобы выровнять его по объективу. Включите микроскоп и запустите программное обеспечение для обработки изображений. Нажмите на значок микроскопа на панели инструментов. После инициализации нажмите кнопку Конфигурация, выберите живую ячейку на панели заданий и PBS в качестве среды. Затем перейдите на вкладку калибровки на панели управления программного обеспечения для обработки изображений. Установите осевое положение объектива и конденсорных линз, выбрав фокус и поверхность соответственно. Теперь нажмите режим сканирования, чтобы вручную отрегулировать линзы и убедиться, что диаграммы освещенности центрированы и почти статичны. Выберите обычный режим, затем отрегулируйте этап перевода, чтобы переместить ячейку в поле зрения и сосредоточиться на образце. Настройте этап перевода, чтобы найти область без ячеек. Выберите «Калибровка» для захвата нескольких 2D-голограмм под разными углами освещения. Настройте этап трансляции так, чтобы ячейка располагалась по центру, затем перейдите на вкладку сбора данных и выберите «3D-снимок», чтобы зафиксировать томограмму ячейки. Чтобы визуализировать голографические томограммы, выберите данные на панели навигации по данным, щелкните правой кнопкой мыши и нажмите кнопку «Открыть». На панели менеджера данных нажмите на томограмму RI. На панели визуализации объема выберите RI и нарисуйте четыре прямоугольных цветных прямоугольника на холсте RI. Установите минимальное и максимальное значения диапазона RI для каждого цветового поля, а затем свяжите непрозрачность и цвет с каждым прямоугольником. Нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить определенные диапазоны зарезервированных элементов и цветовые поля. Чтобы получить количественные дескрипторы морфологии клетки, используйте интерфейс анализа. Выберите «Вручную» на панели сегментации, затем установите 1,3450 в качестве порога RI и нажмите «Применить». Нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить рассчитанные морфологические индексы. Спектральное картирование комбинационного рассеяния света показало пространственное распределение цитоплазмы, ядра, фенилаланина и липидов в отдельных клетках MDA-MB-231. Отчетливые спектральные пики комбинационного рассеяния, соответствующие цитоплазме, ядру, фенилаланину и липидам, были подтверждены в области отпечатков пальцев между 600 и 1800 обратными сантиметрами. Тепловые карты показателя преломления одиночных клеток выявили внутреннее распределение субклеточных компонентов в осевой плоскости XY, сагиттальной плоскости YZ и корональной плоскости XZ. С помощью 3D-томографической реконструкции были выявлены области объемного показателя преломления, соответствующие внутренним подструктурам. Количественные морфологические измерения одной клетки MDA-MB-231 показали различные дескрипторы морфологии клетки, с общим объемом 4024,189 кубических микрометров и площадью поверхности 2383,707 квадратных микрометров, со средним показателем преломления 1,356.