Генерация целых бактериальных геномов из клинических образцов с помощью рабочего процесса целевого обогащения
15 августа 2025 г.
В этой статье мы представляем протокол, позволяющий проводить полногеномное секвенирование бактериальных инфекций, передающихся половым путем, из клинических образцов с использованием целевого обогащения. Этот новый метод, основанный на синдромных панелях, решает проблемы, связанные с большим количеством ДНК человека и низкой бактериальной нагрузкой, облегчая геномный надзор за Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum и Mycoplasma genitalium.
Геномы могут предоставить информацию о происхождении, передаче и способностях патогена. Для некультивируемых бактерий эта информация может быть получена только путем целевого обогащения. Секвенирование бактериальных патогенов непосредственно из клинических образцов является сложной задачей из-за огромного количества ДНК человека, разнообразной микробиоты и чрезвычайно низкой бактериальной нагрузки.
Во многих случаях культура не является вариантом, из-за метода отбора проб и привередливых бактерий. Применяя эту технологию к бактериям, передающимся половым путем, мы обнаружили новую линию ВЛГ Chlamydia trachomatis под названием ompA-генотип L4 и подтвердили глобальное расширение доминирующей линии ВЛГ, предоставив ключевую информацию для молекулярной диагностики и эпидемиологического надзора. Этот протокол обогащения прогресса обеспечивает полное восстановление генома из положительных клинических образцов с диагностированной ИППП.
Мы обнаружили, что этот метод превосходит метагеномное глубокое секвенирование, истощение ДНК хозяина и адаптивное секвенирование нанопор. Мы исследуем циркулирующие штаммы этих патогенов в Европе и в Аргентине. Это может дать информацию о передаче инфекции и контроле антимикробной терапии.
Для начала измерьте концентрацию ДНК в экстрактах ДНК из клинических образцов с помощью чувствительного и точного метода, основанного на флуоресценции. Разбавьте каждый образец ДНК с помощью воды, не содержащей нуклеаз, до 10-200 нанограммов в конечном объеме 17 микролитров в каждой полоске ПЦР-пробирки. Добавьте 3 микролитра мастер-смеси для фрагментации в каждую лунку, содержащую 17 микролитров разбавленной ДНК.
Делайте пипеткой вверх и вниз 20 раз, чтобы тщательно перемешать. Затем запечатайте полоску для ПЦР-пробирки. Вращайте полосу на высокой скорости в течение 10 секунд и вращайте ее на короткое время, чтобы собрать содержимое.
Затем поместите полоску для ПЦР-пробирки в термоамплификатор и запустите предварительно запрограммированный протокол фрагментации и инкубации. Далее приготовьте концевой ремонт и мастер-смесь dA-хвостохранилища, как показано в таблице. Сделайте вихрь и раскрутите трубку, как показано ранее, и держите ее на льду.
Затем пипеткой нанесите 20 микролитров концевого репарации и dA-хвоста в каждую лунку, содержащую 50 микролитров фрагментов ДНК. Запечатайте полосу и закрутите на высокой скорости в течение восьми секунд. После короткого вращения полоски поместите ее обратно в термоамплификатор.
После завершения программы термоамплификатора положите полоску для ПЦР-пробирки на лед. Далее добавьте 25 микролитров мастер-смеси для лигирования комнатной температуры, которая была приготовлена за 30 – 45 минут до этого в каждую лунку, содержащую фрагменты ДНК. Добавьте в каждую лунку по 5 микролитров переходной смеси олиго для библиотек с тегами NBC.
Немедленно поместите полоску из ПЦР-пробирки обратно в термоамплификатор и продолжите программу. Чтобы начать очистку ДНК, извлеките магнитные шарики при температуре 4 градуса Цельсия и дайте им нагреться до комнатной температуры перед использованием. Затем добавьте по 80 микролитров в каждую лунку для пробы.
Поместите полоску для ПЦР-пробирки на магнитную подставку и дважды промойте каждую лунку 200 микролитрами 70%-ного этанола. Подождите одну минуту во время каждой стирки и осторожно удалите этанол, не повреждая магнитные шарики. После смешивания и инкубации шариков с 35 микролитрами воды, не содержащей нуклеаз, в течение пяти минут осторожно отсасывайте очищенную надосадочную жидкость из каждой лунки и перенесите ее в соответствующую лунку в новой полоске для ПЦР-пробирки.
Положите новую полоску для ПЦР-пробирки на лед и выбросьте магнитные шарики. Возьмите приготовленную реакционную смесь для предварительного захвата ПЦР и добавьте ее по 11 микролитров в каждую лунку образца, содержащую очищенную библиотеку ДНК. Добавьте 5 микролитров выбранного индекса прайм-репарации в каждую реакцию и запечатайте полоску ПЦР-пробирки.
Запустите программу термоамплификатора для амплификации ПЦР, как указано в таблице, чтобы выполнить ПЦР перед захватом. Добавляйте полоску для ПЦР-пробирки только после того, как термоамплификатор достигнет 98 градусов Цельсия. После завершения ПЦР перед забором проведите еще одну очистку на основе бусин для очистки библиотеки.
Инкубируйте продукт ПЦР с помощью магнитных шариков. Затем поместите пробирку с ПЦР-полоской на устройство для магнитной сепарации и подождите от 5 до 10 минут, пока раствор не станет прозрачным. Пока полоска остается на магнитной подставке, осторожно извлеките и выбросьте прозрачную надосадочную жидкость из каждой лунки.
Затем нанесите ДНК на 15 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, и измерьте концентрацию ДНК в очищенной библиотеке ДНК. Для гибридизации образца запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с указанным здесь протоколом. Запустите программу и сразу же поставьте ее на паузу.
Разбавьте от 500 до 1000 нанограммов приготовленных библиотек ДНК до конечного объема 12 микролитров, используя воду, не содержащую нуклеаз. После вортексирования и вращения смеси блокаторов олигонуклеотидов добавьте по 5 микролитров в каждую пробирку с образцом. Запечатайте полоску ПЦР-пробирки и поместите ее в термоамплификатор.
Приостановите работу термоамплификатора, когда он достигнет третьего шага протокола. Добавьте 13 микролитров подготовленной гибридизационной смеси зонда комнатной температуры в каждый образец, сохраняя полоску внутри термоамплификатора. Медленно перемешайте пипеткой вверх и вниз от 8 до 10 раз.
Убедитесь, что в нем нет пузырьков воздуха, и поместите полоску обратно в термоамплификатор. Затем убедитесь, что все пробирки плотно закрыты. Чтобы захватить гибридизованную библиотеку, перенесите весь объем из каждой пробирки в соответствующие пробирки, содержащие 200 микролитров предварительно промытых шариков стрептавидина.
Соберите шарики стрептавидина перед промывкой с помощью буфера для стирки комнатной температуры. После того, как полоска для ПЦР-пробирки будет извлечена из магнитного сепаратора, добавьте 200 микролитров высокотемпературного буфера для промывки, предварительно нагретого до 70 градусов Цельсия, и повторно суспендируйте шарики, пипетируя вверх и вниз. Запечатайте полосу трубы, сделайте вихрь на высокой скорости и быстро вращайтесь, как было показано ранее.
Поместите герметичную полоску пробирки в блок термоамплификатора при температуре 70 градусов Цельсия и выдерживайте в течение 5 минут. Перенесите полоску ПЦР-пробирки из термоамплификатора обратно в магнитный сепаратор при комнатной температуре. Подождите одну минуту, пока раствор не станет прозрачным.
Затем осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 25 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, в каждую пробирку, содержащую шарики. Запрограммируйте термоамплификатор в соответствии с приведенной здесь таблицей.
Добавьте 25 микролитров приготовленной реакционной смеси после захвата ПЦР в каждую пробирку с образцом. Перемешайте реакцию до тех пор, пока суспензия не станет однородной, и надежно запечатайте полоску ПЦР-пробирки, не вращая ее. Поместите герметичную полоску из ПЦР-пробирки в термоамплификатор.
После переноса продукта ПЦР в свежую пробирку добавьте 50 микролитров суспензии в каждую пробирку с образцом и проведите очистку ДНК, как показано ранее. Измерьте концентрацию ДНК в окончательной очищенной библиотеке с помощью метода количественного определения на основе флуоресценции. Обогащение мишенью привело к значительно более высокому проценту целевых прочтений и, следовательно, полных геномов по сравнению с прямым секвенированием всех протестированных патогенов, включая Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum и Mycoplasma genitalium.
Успешное секвенирование генома преимущественно наблюдалось в образцах с пороговыми значениями цикла кПЦР ниже 30 для всех четырех патогенов. С четкой обратной корреляцией между значениями КТ и процентом целевых считываний для Chlamydia trachomatis. Использование температуры гибридизации 62,5 градуса Цельсия по сравнению с предыдущими 65 градусами Цельсия улучшило покрытие генома для Mycoplasma genitalium без снижения производительности для других целевых патогенов.
Филогенетический анализ геномов Chlamydia trachomatis из Аргентины показал кластеризацию многих образцов внутри клады L2b и выявил новую линию, предложенную как ompA-генотип L4, отделенную от всех предыдущих геномов LGV примерно 600 однонуклеотидными полиморфизмами.
Обзор
В данной статье представлен протокол полногеномного секвенирования бактериальных инфекций, передающихся половым путем, в клинических образцах с использованием таргетного обогащения. Данный метод позволяет решить проблемы, связанные с избытком человеческой ДНК и низкой бактериальной нагрузкой, что делает возможным геномный надзор за ключевыми патогенами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Геномика
- Инфекционные заболевания
Теоретические основы
- Геномы позволяют получить сведения о происхождении, путях передачи и возможностях патогенов.
- Целевой обогащение критически важно для некультивируемых бактерий.
- Прямое секвенирование клинических образцов затруднено наличием человеческой ДНК и низкой бактериальной нагрузкой.
- Методы культивирования могут быть неприменимы для привередливых бактерий.
Цель исследования
- Разработать протокол секвенирования бактериальных ИППП непосредственно из клинических образцов.
- Улучшить молекулярную диагностику и эпидемиологический надзор.
- Исследовать циркулирующие штаммы патогенов в различных регионах.
Используемые методы
- Измерение концентрации ДНК с помощью методов флуоресценции.
- Фрагментация и репарация концов образцов ДНК.
- ПЦР-амплификация и гибридизация библиотек ДНК.
- Очистка библиотек с использованием магнитных частиц.
Основные результаты
- Обнаружение новой линии Chlamydia trachomatis LGV.
- Подтверждение глобального распространения доминирующей линии LGV.
- Протокол превосходит метагеномное глубокое секвенирование и другие методы.
- Потенциал для анализа динамики передачи инфекции и оптимизации использования противомикробных препаратов.
Выводы
- Разработанный протокол позволяет полностью восстановить геном возбудителей ИППП.
- Он предоставляет важные сведения для надзора в области общественного здравоохранения.
- Будущие исследования будут сосредоточены на циркуляции штаммов в Европе и Аргентине.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Прямое полногеномное секвенирование бактериальных ИППП из клинических образцов позволяет устранить критическое узкое место в геномике инфекционных заболеваний, преодолевая трудности, связанные с низкой нагрузкой патогена и высоким фоном человеческой ДНК. Данный рабочий процесс обогащения целевых последовательностей обеспечивает надежный геномный надзор, отслеживание антимикробной резистентности и выявление линий для привередливых, некультивируемых патогенов. Этот подход повышает точность прогнозирования и эффективность принятия решений по формированию портфеля в трансляционной микробиологии и исследованиях и разработках в области инфекционных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить комплексную геномную характеристику некультивируемых бактериальных патогенов непосредственно из клинического материала.
- Способствует идентификации новых линий и детерминант резистентности, что позволяет приоритизировать цели.
- Облегчает снижение механистических рисков за счет уточнения разнообразия патогенов и динамики их передачи.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные геномные данные для разработки анализов и средств молекулярной диагностики.
- Повышает степень стандартизации и воспроизводимости за счет обогащения ДНК патогена на фоне ДНК хозяина.
- Обеспечивает масштабируемость рабочих процессов для высокопроизводительного мониторинга и скрининга патогенов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты геномного анализа с поиском трансляционных биомаркеров для мониторинга антимикробной резистентности.
- Обеспечивает преемственность от анализа клинических образцов до разработки доклинических моделей для исследований инфекционных заболеваний.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении за счет предоставления практически значимых геномных данных для эпидемиологического надзора.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол обогащения целевых последовательностей интегрирован в непрерывный процесс выявления инфекционных заболеваний, связывая анализ клинических образцов, геномный надзор и трансляционные исследования.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о разнообразии патогенов и механизмах резистентности непосредственно на образцах пациентов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные геномные данные, пригодные для последующей разработки аналитических методов.
- Аналитика: предоставляет данные секвенирования высокого разрешения и результаты филогенетического анализа для сравнительных исследований.
- Трансляционные исследования: связывает клиническую геномику с доклинической валидацией и подбором биомаркеров для контроля за применением противомикробных препаратов.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемый рабочий процесс для различных бактериальных патогенов и условий эпидемиологического надзора.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при идентификации патогенов и определении профилей резистентности.
- Операционная ценность: стандартизирует обработку образцов и секвенирование для получения воспроизводимых и масштабируемых результатов.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о целесообразности инвестиций в программы диагностики и эпидемиологического надзора.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию мишеней инфекционных заболеваний и инициатив по надзору с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярной биологии, геномики и биоинформатики для выполнения рабочего процесса и анализа данных.
- Необходим доступ к оборудованию для высокочувствительного количественного анализа с использованием флуоресценции, термоциклерам и платформам для высокопроизводительного секвенирования.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов обработки образцов и интерпретации данных.
- Метод применим к различным бактериальным патогенам, однако эффективность может варьироваться в зависимости от бактериальной нагрузки и типа образца.
- Успех восстановления генома зависит от значений Ct при qPCR и оптимизации температуры гибридизации.
