Томография со сканирующей просвечивающей электронной микроскопией в вирусологии: 3D-визуализация замороженных под высоким давлением сублимационных образцов

Вирусная инфекция может вызвать значительные изменения в клеточной инфраструктуре. Для визуализации этих изменений в трёх измерениях мы используем STEM-томографию для визуализации вирусно-инфицированных клеток. STEM-томография требует много времени и труда.

Это делает оптимальную подготовку образца необходимой для биологических образцов, таких как наборы, инфицированные вирусами. Обычная STEM-томография ограничена образцами болезней размером примерно 200 нанометров. Наш протокол позволяет проводить 3D-изображение более толстых срезов.

Это позволяет более полно визуализировать клетки, инфицированные вирусом, и ультраструктурные изменения. Многие онколитические вирусы изначально проходят клинические испытания, поэтому исследователи и разработчики по всему миру работают вместе, а наука расширяет границы лечения рака, а современные методы, такие как электронная микроскопия и STEM-томография, вносят новые открытия. Мы продолжим отвечать на вирусологические вопросы, используя STEM-томографию и сочетая её с новыми протоколами подготовки и другими микроскопическими методами.

Для начала заполните LN-бокс жидким азотом в подготовке к обработке и переносу замороженных сапфировых дисков из держателя высокого давления или HPF в капсулы для хранения. Держите рядом дьюар, наполненный жидким азотом, чтобы заполнить LN-бокс по мере необходимости во время заморозки. Держите наготове утеплённые пинцеты.

Подготовьте контейнеры для образцов, которые будут хранить сапфировые диски после HPF. Убедитесь, что у них есть крышка и несколько отверстий для залива жидкого азота, а также маленькие грузи, чтобы они не плавали. Поместите контейнер с этикетками в LN-коробку для предварительного охлаждения перед использованием.

Затем поместите образцы в инкубатор. Осмотрите сапфировые диски под перевёрнутым световым микроскопом, чтобы убедиться в достаточном числе клеток и хорошем их качестве перед началом заморозки под высоким давлением. Для проведения HPF возьмите один сапфировый диск из посевной чаши и быстро нанесите его на фильтрующую бумагу, чтобы удалить лишние материалы.

Поместите диск в держатель HPF так, чтобы углеродное покрытие было обращено вверх, чтобы цифра два была читаемой. Окуните золотой спейсер в гексадекан и аккуратно положите его на сапфировый диск. Разместите второй сапфировый диск сверху прокладки так, чтобы углеродное покрытие было обращено вниз, чтобы образовать сэндвич-конфигурацию с элементами, направленными друг к другу, убедитесь, что воздух не задерживается.

Аккуратно и быстро закройте держатель HPF, чтобы снизить нагрузку на образец. Вставьте держатель HPF в морозильник высокого давления. Закройте её согласно инструкции производителя и начните процесс заморозки.

Далее перенесите держатель HPF в LN-бокс. Затем переложите наконечник, несущий сапфировые диски, в предварительно охлаждённую LN-коробку. Аккуратно извлекайте диски из держателя.

Поместите закрытые криофлаконы, наполненные раствором свободного замещения, в свободное устройство для замещения, предварительно охлаждённое до минус 90 градусов Цельсия. Подождите, пока раствор не достигнет той же температуры. Предварительное охлаждение пинцета, скальпеля и плоскогубцев или больших пинцетов, погружая их в жидкий азот для переноса сапфировых дисков.

Перенесите замороженные образцы высокого давления в устройство свободной замещения. Разделяйте сапфировые диски по одному, сохраняя их в жидком азоте. И быстро переместить каждый диск отдельно в криофлакон с раствором свободной замены, обеспечивая полное погружение диска.

После закрытия крио-флакона немедленно поместите его обратно в свободное устройство замены. Когда все образцы размещены, начинайте процесс замены. Как только образцы достигнут 20 градусов Цельсия.

Продолжайте промывать образцы три раза по 30 минут с 100% ацетоном. Чтобы предварительно вставить образцы, инкубировать их в одну треть эпоксидной смолы и две трети ацетона в течение одного часа. После инкубации образцов с двумя третями эпоксидной смолы и одной третью ацетона в течение часа заменяют раствор на 100%эпоксидную смолу и инкубацируют ночью с открытой крышкой флакона, чтобы оставшийся ацетон испарился на следующий день, затем сапфировые диски перемещён в новые маркированные реакционные трубки, заполненные свежеприготовленной эпоксидной смолой.

Разместить диски горизонтально, поддерживая стенку трубки, убедившись, что сторона с ячейками направлена вверх. Затем поместите реакционные трубки с открытыми крышками в духовку, выровненную на 60 градусов Цельсия, и дайте смоле полимеризироваться не менее 48 часов. После полимеризации эпоксидной смолы погрузите кончик закрытой реакционной трубки в жидкий азот примерно на 10 секунд.

Ударите по реактивной трубке на столе, чтобы освободить смолянный блок. Сапфировый диск легко отделяется от углеродного слоя, который остаётся прикреплённым к встроенным ячейкам. Выберите область, интересующую в вложенной выборке, и сузьте размер выборки до интересующей области.

Используя ультрамикротон с алмазным ножом, собирайте секции толщиной около одного микрометра на параллельной решетке, обработанной поли-L-лизином, для STEM-визуализации и STEM-томографии. Обрабатывайте участки коллоидным золотом в качестве фидуциальных маркеров и наносите углеродное покрытие. После разрезания и осмотра ультратонких срезов образцы готовы к визуализации.

Исходя из исследовательского вопроса, вставляйте либо детектор яркого поля, либо детектор тёмного поля, либо оба варианта. Активируйте режим сканирования и получите тестовое изображение образца. Выберите увеличение больше 800 000 раз, что больше конечного желаемого увеличения.

Рядом с областью интереса отрегулируйте фокус и корректируйте астигматизм, избегая прямого воздействия луча на критических областях выборки. Установите эксцентричную высоту так, чтобы интересующая область, или ROI, оставалась центрированной по всему диапазону наклона. Выберите элемент рядом с ROI, подведите её в центр, сфокусируйтесь, исправьте астигматизм и наклоните сцену по шагу до минус 72 градусов.

Чтобы выбрать поле зрения, перейдите обратно к ROI, выведите его в фокус и сделайте обзорное изображение. Установите окончательное требуемое увеличение для захвата наклонной серии. Настройте автоматический набор изображений по наклону, от минус 72 до плюс 72 градусов и каждые 1,5 градуса.

Запустите автоматическое приобретение серии наклона. Репрезентативные виртуальные срезы из термограммы STEM показали, как ориентация вирионов влияет на видимость характерной формы пули в двумерных изображениях. Только вирионы, выровненные параллельно плоскости обзора, имели полную чётко очерченную морфологию пули, а другие выглядели круглыми или вытянутыми в зависимости от угла наклона.

Для преодоления ориентационных ограничений двумерной визуализации была использована STEM-томография для захвата крупных кластеров зарождающихся рекомбинантных вирусов вируса везикулярного стоматита, что позволило оценить форму вирионов в трёх измерениях без направленного смещения. Боковой вид термограммы подтвердил объёмное преимущество STEM-томографии, захватывающей множество целых вирионов в одном сечении толщиной 600 нанометров, в отличие от ограниченного отбора проб, возможного при 200-нанометровом срезе TEM.