Молекулярная картография с двойной модальностью: интеграция мультиплексного детектирования мРНК с масс-цитометрией с визуализацией белков
14 ноября 2025 г.
В этом протоколе подробно описана методология детектирования мультиплексной мРНК с помощью массовой цитометрии с визуализацией белка в срезах ткани, залитых формалином и фиксированным парафином.
Мы сосредотачиваемся на специальной биологии для дальнейшего изучения молекулярных механизмов рака яичников в надежде найти новые терапевтические цели и биомаркеры для прогнозирования выживаемости пациентов. Одной из текущих задач IMC является диссекция белка с меньшим содержанием, труд валидации и титрации антител, а также сложная и трудоёмкая классификация пикселей во время анализа. Начните с удаления лишней жидкости с подготовленных FFPE-шлайков.
Достаньте противень для контроля влажности из духовки и поставьте держатель затвора в противень. Затем тщательно изобразите вихрь РНК-ISH Amplifier 3 и добавьте достаточно реагента, чтобы полностью покрыть каждый участок ткани на слайдах. Закройте противень и поставьте его в духовку для гибридизации на 30 минут при 40 градусах Цельсия.
Во время инкубации подготовьте смесь металлических олигонуклеотидов, разбавляя каждый олиго в соотношении один к 15. Тщательно перемешайте металлический олиго и оставьте при комнатной температуре до дальнейшего использования. Теперь снимите противень для контроля влажности из духовки.
Достаньте держатель для затвора из противня и поставьте противень обратно в духовку. Затем поместите слайды в прозрачный держатель, предварительно промытый водой без нуклеаз. Стирайте стекли в буфере для стирки под лёгким перемешиванием две минуты.
После удаления лишней жидкости из стеклян достаньте противень для контроля влажности из духовки и поставьте держатель затвора в противень. Добавьте заранее подготовленные смешанные металлические олигонуклеотиды, чтобы полностью покрыть каждый участок ткани. Теперь полностью закройте противень и поставьте его в духовку для гибридизации на 45 минут при 40 градусах Цельсия.
Снимите противень для контроля влажности из духовки для гибридизации, достаньте держатель затвора и верните пустой противень в духовку. Чтобы блокировать неспецифические участки связывания, добавьте достаточный объём блокирующего буфера, чтобы полностью покрыть каждый участок ткани на слайде, и инкубировать стекли при комнатной температуре в течение 30 минут. Во время инкубации препаратов подготовьте смесь антител, разбавляя антитела с помощью буфера разбавления антител.
После завершения инкубации сбросьте буфер с тканевых слайдов и выдайте достаточно предварительно подготовленной смеси антител, чтобы полностью покрыть тканевые срезы. Затем поместите слайды в камеру с влажностью и инкубируете их ночью при четырёх градусах Цельсия. Для приготовления свежего раствора с иридиевым интеркалатором сделайте разбавление 1 к 2000 000 из 500-микромолярного раствора с использованием РНаз-свободного TBS.
Положите слайды в прозрачный держатель для затвора, предварительно вымытый водой без нуклеазы, и помойте их в буфере TBS-T, слегка перемешивая в течение пяти минут. Затем, чтобы покрасить стекла, добавьте подготовленный рабочее раствор Iridium и инкубуйте пять минут при комнатной температуре. После этого положите слайды в прозрачный держатель, предварительно промытый водой без нуклеаз.
Промой стекли два раза в буфере TBS-T с лёгким перемешиванием в течение пяти минут. Затем быстро окуньте препараты в дважды дистиллированную воду, чтобы предотвратить кристаллизацию соли от TBS на ткани. Высушите стекли под химическим капюшоном в течение 10 минут и храните при 4 градусах Цельсия до получения изображения.
Загрузите подготовленный затвор в абляционную камеру системы массовой цитометрии. Сделайте панорамное изображение слайда, чтобы определить область интереса. С помощью программного обеспечения для получения изображений отметьте нужные области интереса на панорамном изображении.
Примените шаблон приобретения в программном обеспечении для получения изображений. И регулировать мощность лазера в зависимости от типа образца. Теперь начинайте процесс лазерной абляции.
Измеряйте количество каждого изотопа с помощью детектора, который преобразует данные в цифровую форму для анализа. Статус активации CD8 T-клеток оценивался с помощью совместного обнаружения гранзима B как на уровнях мРНК, так и на уровне белка, а также с положительной интерферон-гамма-положительностью. Было показано, что фибробласт, ассоциированный с раком, экспрессирует белок MFAP5 и мРНК POSTN, оба маркера агрессивности фибробластов, связанных с раком.
Было показано, что Т-клетка CD4 совместно экспрессирует мРНК IL17A и IL6, что соответствует идентичности клеток TH17. Наблюдались CD4 Т-клетки, экспрессирующие мРНК IL13. Кератин-положительные CD47-положительные опухолевые клетки были выявлены рядом с CD8 T-клетками.
Было показано, что активированная Т-клетка CD8 экспрессирует белок CD25. Сопоставимое окрашивание мРНК THBS2 и CD47 наблюдалось между протоколами, конъюгированными металлом и флуоресцентными метками.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описана методика мультиплексного детектирования мРНК с помощью масс-цитометрии с визуализацией белков в срезах тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином. Основное внимание уделено изучению молекулярных механизмов рака яичников для поиска новых терапевтических мишеней и биомаркеров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Онкология
Теоретические основы
- Понимание рака яичников на молекулярном уровне.
- Трудности в обнаружении белков с низкой экспрессией.
- Необходимость валидации и титрования антител.
- Сложность классификации пикселей в процессе анализа.
Цель исследования
- Поиск новых терапевтических мишеней для лечения рака яичников.
- Идентификация биомаркеров, позволяющих прогнозировать выживаемость пациентов.
- Совершенствование методик детектирования белков в образцах тканей.
Используемые методы
- Подготовка предметных стекол с FFPE-образцами.
- Использование лотков контроля влажности для гибридизации.
- Применение реагента RNA-ISH Amplifier 3.
- Гибридизация при контролируемой температуре.
Основные результаты
- Успешное multiplex-детектирование мРНК и белков.
- Усовершенствованная методика анализа срезов тканей.
- Представление о молекулярных механизмах рака яичников.
- Потенциал для идентификации новых биомаркеров.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание биологии рака яичников.
- В нем рассматриваются проблемы, возникающие при детекции белков.
- Он закладывает основу для будущих разработок в области терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Интеграция мультиплексного детектирования мРНК с визуализацией белков методом масс-цитометрии позволяет проводить одновременное пространственное транскриптомное и протеомное профилирование в одном срезе ткани, что способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней при поиске новых препаратов в онкологии. Этот двухмодальный подход преодолевает ограничения детектирования только с помощью антител и спектрального перекрытия флуоресценции, обеспечивая более высокую прогностическую достоверность при идентификации биомаркеров и терапевтических мишеней. Данный метод поддерживает принятие решений по портфелю с учетом рисков, предоставляя количественные, пространственно разрешенные молекулярные данные, критически важные для ранних этапов разработки и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую сопоставить экспрессию мРНК и белков в одном и том же клеточном микроокружении.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней, выявляя как транскрипционный прайминг, так и сигнализацию на уровне белков.
- Способствует снижению механистических рисков за счет уточнения активности путей и состояния клеток в тканях, имеющих отношение к заболеванию.
- Повышает прогностическую достоверность при приоритизации потенциальных мишеней и биомаркеров.
Скрининг и разработка методов анализа
- Позволяет подготавливать валидированные мультиплексные тканевые системы для последующего скрининга и оценки воздействия соединений.
- Обеспечивает получение количественных и воспроизводимых результатов для аналитов мРНК и белков in situ.
- Снижает избыточность анализа за счет интеграции детектирования аналитов в единый рабочий процесс.
- Минимизирует необходимость в постобработке и компенсации по сравнению с методами на основе флуоресценции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет пространственное молекулярное профилирование с архитектурой тканей, имеющей значение для заболевания, для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет поддержки мультиплексных пространственно-разрешенных методов считывания.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, предоставляя надежные данные по нескольким аналитам из клинически значимых образцов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот двухмодальный рабочий процесс объединяет этапы первичного поиска, валидации мишеней и трансляционных исследований, обеспечивая возможность детального молекулярного картирования в срезах тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE).
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем картирования коэкспрессии мРНК и белков in situ.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу мультиплексные срезы тканей с количественными данными для последующей оценки.
- Аналитика: Позволяет получать цифровые измерения на основе изотопов для надежного статистического сравнения клеточных фенотипов.
- Трансляционные исследования: Способствует согласованию биомаркеров и валидации значимых для заболевания показателей в сложных микроокружениях тканей.
- Корпоративное повторное использование: Создает масштабируемую, многоразовую платформу для пространственного профилирования нескольких аналитов в рамках портфелей по онкологии и иммунологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при поиске мишеней и биомаркеров.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы мультиплексного детектирования и сводит к минимуму технические артефакты, вызванные ограничениями флуоресценции или антител.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и проводить капиталоэффективную сортировку портфеля на основе надежных молекулярных данных.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение высокодостоверных мишеней и биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами масс-цитометрии визуализации и гибридизации in situ.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для детекции с использованием металлического зонда и цифрового анализа.
- Требуется тщательная валидация антител и зондов для обеспечения специфичности и чувствительности.
- Может потребоваться адаптация для различных типов тканей или моделей заболеваний в зависимости от содержания аналитов и архитектуры ткани.
- Сложность анализа возрастает при увеличении мультиплексности и пространственного разрешения, что требует использования передовых вычислительных инструментов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:32
Hybridizing RNA-ISH Amplifier 3 to Ovarian Cancer FFPE Sections
1:47
Hybridizing Metal Oligos to the Tissue Sections
2:30
Hybridizing Metal Conjugated Antibodies to the Tissue Sections
3:20
DNA Staining to Prepare Tissue Sections for Imaging
4:33
Image Acquisition
5:35
Results
