Комплексное пространственное профилирование видонезависимых транскриптомов с помощью стереосеквенирования

Наши исследования сосредоточены на детальном описании микросреды опухоли яичников с целью выявления предиктивных и терапевтических биомаркеров. Например, мы хотели бы найти маркеры для прогнозирования химиореакции и резистентности к нему или новые терапевтические мишени для лечения второй линии. Экспериментальные задачи включают обработку образцов, их качество и продолжительность обработки образца.

В анализе данных возникают такие проблемы, как разреженность данных, аналогичная другим процессам с отдельными клетками, а также картографирование областей, особенно повторяющихся областей. После удаления стерео-секвенирующего N-чипа из упаковки запишите идентификационный номер чипа. Не трогая поверхность N-Chip, очистите стекло 100% этанолом.

С помощью микропипетки аккуратно нанесите 10 микролитров ультрафиолетовой отверждаемой керамической смолы по краю стерео-секвенирующего N-чипа. Используйте герметичный поролоновый тампон, чтобы удалить лишнюю смолу, оставив только тонкую линию вокруг края скола. Вставьте затвор в устройство для ультрафиолетового отверждения, убедитесь, что поверхность чипа не тронута.

Теперь положите чип из смолы поверх непрозрачной маски на 405-нанометровом ультрафиолетовом источнике, чтобы осветить заднюю часть затвора и затвердеть в течение пяти минут. После отверждения используйте герметичные пенопластовые палочки, пропитанные 100% молекулярным этанолом, затем 70% этанолом, и, наконец, воду без нуклеазы для очистки вокруг края смолы. Окуните чип три раза в свежую воду без нуклеазы с помощью конической трубки объемом 50 миллилитров.

Используя сжатый воздух, высушите щепу с полной силой воздуха под углом примерно 60–80 градусов, двигаясь по диагонали по поверхности с расстояния около пяти сантиметров. Затем равномерно нанесите 150 микролитров раствора Poly-L-Lysine по всей поверхности чипа и инкубируйте чип 10 минут при комнатной температуре. Затем удалять раствор поли-L-лизина из микросхемы.

После второй стирки аккуратно высушите края затвора, не касаясь поверхности с отколотой. Плотно высушите щепу с помощью сжатого воздуха, как было показано ранее. При сечении ткани FFPE не трогайте чип напрямую, а покрывайте тканью только 80% чипа.

Чтобы подготовить два микролитра одноцепочечного раствора для окрашивания ДНК в буфере SSC, разведите одноцепочечный реагент Кубит 5X SSC-буфером. Создайте мастер-смесь раствора для окрашивания с разбавлением ингибитора рибонуклеазы от одного до 20, одноцепочечного раствора ДНК разбавления от одного до 200 и оставшегося объёма с 5-кратным буфером SSC. Добавьте 150 микролитров раствора для окрашивания на каждую стружку и инкубируем в темноте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем аккуратно удалите раствор для окрашивания с угла каждой щепы с помощью пипетки. После дважды промывания чипа буфером 0.1X SSC в течение 10–15 секунд аккуратно высушите края затвора. Добавьте примерно три-пять микролитров глицерина на затвор для крепления.

Сбросьте накладку примерно с одного сантиметра над затвором, чтобы она оставалась ровной и не касалась поверхности скола. Захватывайте флуоресцентные изображения одноцепочечной ткани, окрашенной ДНК, с помощью широкоугольного микроскопа, обеспечивая 10% совпадения между плитками изображения. Сшивайте полученные изображения в программном обеспечении для обработки изображений, таких как ImageJ, сначала используя теоретическое перекрытие для генерации приблизительных позиций плиток, а затем применяя вычислительное перекрытие пикселей для точной настройки плитки.

Обработайте сшитые изображения в программном обеспечении StereoMap и убедитесь, что контроль качества изображения проходит, прежде чем продолжить. Погрузите стереосеквенирующий затвор в 30 миллилитров буфера 0,1X SSC, пока клапан не отсоединится. Убедитесь, что реагент FFPE для дескшипинга находится при комнатной температуре, и проверьте его на частицы.

Включите термоциклер и установите на 30 градусов Цельсия для равновесия, 95 градусов Цельсия для 30-минутной инкубации и бесконечное удержание на 4 градусах Цельсия. Соберите прокладку кассеты и вставьте стереосеквенирующий слайд в кассету. Затем добавьте реагент FFPE для декроссшиппинга в люк стереосеквенирующей слайд-кассеты, наклейте герметичную ленту на кассету и убедитесь, что она плотно запечатана.

Начните 30-минутную инкубацию при 95 градусах Цельсия. Через 10 минут поместите 25 миллилитров метанола в 50-миллилитровый контейнер в морозильнике при температуре 20 градусов Цельсия, подготовив примерно один миллилитр на каждый слайд для последующего использования. После удаления чипа с термоциклера перенесите затворную кассету на стол и откройте герметичную ленту.

С помощью пипетки извлекаем и сбросьте реагент FFPE для декросслинкинга из кассеты. После полного удаления реагента отсоедините кассету и прокладку и сбросьте их. Под стерильным вытяжком высушите край затвора и при необходимости установите новую силиконовую камеру.

Добавьте 500 микролитров охлаждённого метанола из морозильной камеры при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы вся секция была погружена под воду. Предварительно разогрейте раствор PR на сухом блоке при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут перед использованием. После фиксации в вытяжке протри лишний метанол с затвора и дождитесь, пока оставшийся метанол на чипе испарится.

Соберите новую прокладку конца кассеты. После завершения испарения поместите стереосеквенирующий слайд в кассету. Добавьте 200 микролитров предварительно подогретого реагента для прохождения в микросхему.

Наклейте герметичную ленту на кассету с стереосеквенированием и убедитесь, что она плотно запечатана. Проведите обратную транскрипцию, затем высвобождание CDNA и очистку, следуя показаным здесь шагам. Предварительно нагрейте воду без нуклеазы до 37 градусов Цельсия.

Снимите уплотнение с чипа. Энергично проводите пипеты в каждом уголке и в центре скола поверх салфетки, не царапая и не касаясь её. Соберите всю комплементарную смесь для высвобождения ДНК из чипа и перенесите её в центрифугную трубку объемом 1,5 или 2,0 миллилитра.

Добавьте 350 микролитров предварительно нагретой воды без нуклеазы непосредственно на поверхность щепы. Энергично наклоняйте пипетку меньшей пипеткой, наклоняя кончик так, чтобы приложить чистую силу, не касаясь ткани и не царапая сколы. Комбинируйте промывку с 400 микролитрами ранее собранной комплементарной ДНК-смеси, чтобы объединить только материал из одного чипа.

Нанесите на чип 100 микролитров воды без нуклеаз. Запечатайте стереосеквенирующий слайд и храните его в холодильнике до окончания действия протокола. Сегментация по одной клеточке с использованием конвейера SAW была достигнута на срезах FFPE, что позволило отображения на неполиаденилированные РНК, такие как tRNA, TRDMT1.

Интерактивная пространственная визуализация показала предполагаемые типы клеток с помощью собственного программного обеспечения StereoMap, при этом кластеры отображались в различных цветах в увеличенной области ткани. Экспрессия всей ткани неполиаденилированной РНК TRDMT1 была визуализирована с помощью StereoPi. Адаптации протокола решают проблемы полного пространственного профилирования жировых и хрупких тканей в транскриптомике, улучшая адгезию тканей, доступность РНК и обработку стерео-секвенсий на этих сложных типах тканей.

Стерео-секвенция в настоящее время обеспечивает более высокое разрешение, чем другие методы пространственной транскриптомики, с разрешением 500 нанометров против двух микрон. Он также обеспечивает беспристрастный захват, необходимый для изучения микробиома, вирусных и неполиаденилированных транскриптов.