Определение структуры гемагглютинина с субнанометровым разрешением по данным криоэлектронной томографии вирусов гриппа

Наша лаборатория использует структурную биологию для изучения вирусов и эволюции лекарственной устойчивости. В текущей работе мы характеризуем, как гемагглютинин гриппа меняет конформацию при связывании рецепторов. Мы использовали криоэлектронную томографию для визуализации организации и структуры морфологии вируса.

В частности, мы использовали этот метод криоэлектронной микроскопии для изображения плеоморфного вирусного гриппа. Наш протокол позволяет изучать организацию и структуру гемагглютинина гриппа in situ на целых вирусах с субнанометровым разрешением. Это более высокое разрешение позволяет визуализировать ранее скрытые взаимодействия.

Для начала запустите терминал Linux для активации среды Conda. Используйте терминал для активации среды Conda с установленным ISO net. Создайте подпапку с названием tomo folder, затем переместите все томографические файлы в эту папку.

Далее используйте код, чтобы сгенерировать файл со звездой в папке проекта. Используя текстовый редактор, откройте сгенерированный файл звёзды и введите приблизительное значение дефокуса для изображений с уклоном в четвёртую колонку. Теперь запустите команду свёртки CTFD в терминале.

После деконволвации активируйте окружение EMAN2 GUI для начала предварительной обработки для выбора частиц. В томографии кликните левой кнопкой стрелки рядом с исходными данными, выберите импорт томограмм в выпадающем меню и выберите файлы. Затем кликните левой кнопкой стрелки рядом с сегментацией и выберите предварительно обработанные томограммы.

Используйте подходящие стандартные параметры. После предварительной обработки автоматически будет создан информационный каталог с пустыми JSON-файлами, соответствующими базовым именам файлов томографии процессов. Добавьте информацию о ангстреме пикселей в файлы перед продолжением.

Чтобы обучить сверточную нейронную сеть, или CNN, распознавать гликопротеин HA, измените рабочий каталог на расположение используемых томограмм. Затем откройте интерфейс обучения CNN с помощью терминала. Убедитесь, что открыты четыре окна.

Одно содержит информацию о параметрах CNN и томограммах в каталоге, а три других окна — изображения хороших, плохих ссылок и частиц, выбранных CNN. В графическом интерфейсе CNN нажмите на новую опцию для инициализации CNN с стандартной скоростью обучения 0,0001 и размером коробки восемь. В столбце имени файла нажмите левой кнопкой мыши по представительной томографии, чтобы открыть её.

Наведите курсор на открытую томографию и нажмите колесо прокрутки мыши, чтобы открыть новое окно. Кликните левой кнопкой по движению числа N, чтобы пройти по оси Z. Далее, на открытой томографии, используйте панель хороших ссылок, чтобы выбрать 10–20 признаков, соответствующих HA. В позитивном окне появляются положительные образы.

Чтобы удалить его, удержите Shift и кликните по ней левой кнопкой. Теперь переключитесь на панель плохих ссылок и выберите 10–20 ссылок, соответствующих таким признакам, как пустые мембранные участки, плотность RNP, фидуциальные маркеры и мусор. Установите количество повторений на 50 и нажмите на значок поезда, чтобы начать обучение CNN.

После завершения обучения нажмите «подать заявку». Выбранные частицы будут отображаться на томографии в виде синих кругов или их можно увидеть в окне частиц. Продолжайте дорабатывать, выбирая дополнительные положительные и отрицательные ссылки, периодически нажимая «Сохранить» для сохранения прогресса.

Когда CNN работает хорошо, нажмите применить всё, чтобы запустить подбор частиц. Затем оценивайте результаты нескольких томограмм и переучите по мере необходимости. Чтобы сохранить координаты для каждой томограммы, откройте графический интерфейс EMAN2 с помощью команды e2projectmanager.py.

Нажмите на стрелку в разделе subtomogram average и выберите ручной бокс. Теперь введите название томографии и нажмите «Запуск». Затем последовательно кликайте по файлу, сохраняйте шнур коробки и tomogram_ha.

Текст, чтобы сохранить координаты. Перейдите к подпапкам Neural Net и Info Subfolders, чтобы сделать резервную копию и сохранить сеть. HDF, Trainouts.

HDF, сегауты. hdf и boxes3Dref.hdf. Обучить второй CNN обнаруживать белковый слой M1 и присутствие VRNP, изменив размер тренировочной коробки с восьми на 14.

Чтобы курировать частицы, сначала скачайте блокноты из репозитория GitHub. Затем откройте CNN-очистку блокнота IPYNB и загрузите необходимые модули. Загрузите текстовые файлы координат HA и M1 в блокнот.

Рассматривайте их как 3D-облака с помощью открытой 3D-библиотеки. Далее отфильтруйте выбросы координат HA с помощью открытого трёхмерного метода удаления статистических выбросов. Далее вычислите расстояния между облаками точек HA и M1, определив точки HA более чем на 20 пикселей от M1 как выбросы и сохраняйте оставшиеся координаты в выходном текстовом файле.

Соедините все частицы и сохраняйте как звёздные файлы с помощью pts2 star file. IPYNB. С помощью WarpTools извлеките частицы, которые изгибают фактор четыре и выполняйте начальное усреднение субтомограммы в RELION минус четыре с помощью кода. Преобразуйте файл варп-звезды в формат RELION четыре.

Затем генерируйте начальную ссылку с помощью RELION refine-MPI на подмножестве частиц. Выполните 3D-автоуточнение субтомограмм с RELION Refine-MPI. При сходлении повторяйте авто-уточнение с смещением титана на восемь и шагом на два.

Используйте двумерную классификацию для удаления мусорных частиц с помощью RELION. Создавайте звёздные файлы с хорошими классами с помощью кода, затем объединяйте отдельные звёздные файлы. Представительные томограммы выявили плеоморфные вирионы с формами от сферической до вытянутой.

Итоговое среднее значение субтомограммы достигло глобального разрешения 6,0 ангстремов с локальным разрешением от пяти до семи ангстремов. Альфа-спирали и бета-листы были разрешены в финальной реконструкции HA, что подтверждает структурное качество усовершенствованной карты. Участки гликозилирования были идентифицированы в четырёх позициях на головке и стержне HA, что подтверждает видимость плотности гликанов в конечной реконструкции.