Минимально инвазивный метод создания сингенной ортотопической мышиной модели рака легкого

Наши текущие исследования сосредоточены на понимании рака легких и разработке новых методов лечения, совместимых со стандартной терапией, включая химиотерапию, лучевую и иммунотерапию. Мы не смогли найти ортотопическую модель рака лёгких, которая бы устанавливала критерии для конкретного изучения ранней стадии рака легких. Мы работаем над созданием чётких и воспроизводимых рекомендаций для устранения этого пробела в этом протоколе.

Этот протокол минимально инвазивен и прост в выполнении. Кроме того, согласно установленным нами критериям, этот протокол позволяет проводить скрининг точной имплантации опухоли и обеспечивает раннее выявление опухолей с помощью биолюминесцентной визуализации. Этот протокол позволяет учёным изучать ранние стадии рака лёгких в тканях хозяина, что позволяет доклинически развивать новые методы лечения рака и исследовать микроокружение опухоли.

Мы будем использовать эту технику для оценки механизмов и эффективности захватывающих новых методов лечения рака лёгких до клинической практики и надеемся, что это приведёт к дальнейшему уходу за пациентами. Для начала поместите анестезиированную мышь в носовой конус в положении лежа на согревающем устройстве и нанесите офтальмическую мазь на оба глаза мыши. После подтверждения анестезии используйте электрические машинки, чтобы удалить шерсть из прямоугольной области размером два на три сантиметра на левой спинной стороне мыши.

Брить позвоночник по среднему боку, от стола сбоку, последнее ребро снизу, а верхний край лопатки ближе к голове, пока не останется не видно шерсти. Поместите мышь в пустую клетку на подогревающее устройство. Наблюдайте за дыханием, пока мышь не придёт в себя, а затем возвращайте её в домашнюю клетку до операции.

В день сбора клеток добавьте свежую среду с 50 миллиграммами на миллилитр гентамицина в тарелку за три-четыре часа до сбора. Аспирируйте среду из культивирующей пластины и промывайте прикреплённые клетки 1x PBS. Затем инкубировать клетки раствором трипсина ЭДТА в течение одной-двух минут при 37 градусах Цельсия.

Добавьте свежий материал для нейтрализации трипсина. Рассеивайте клетки, аккуратно постукивая или проводя пипетой по пластине. Затем соберите суспензию ячейки в коническую трубку объёмом 50 миллилитров.

Теперь центрифугуйте коническую трубку при 1 200 G в течение трёх минут при комнатной температуре. После подтверждения наличия компактной гранулы на дне аспирируйте супернатант и промывайте гранулу PBS. Суспензируйте промытую клеточную гранулу в PBS, чтобы получить концентрацию примерно от одного до 2 миллионов клеток на миллилитр для подсчёта.

Перед тем, как продолжить, профильтруйте подвеску через 40-микрометровый фильтр. Далее смешайте 10 микролитров суспензии клетки с 10 микролитрами трипан-синего. Загрузите окрашенный образец в гемоцитометр и посчитайте клетки.

Рассчитайте общее количество ячеек и жизнеспособность ячеек. Центрифугуйте клетки при 1 200 G в течение трёх минут при комнатной температуре и аспирируйте PBS, выходя из гранулы. Ресуспензировать клеточную гранулу в 0,5 миллиграмма на миллилитр метра-геля в PBS.

Отрегулировать желаемое количество ячеек при общем объёме инъекции 50 микролитров. Держите подвешенность клетки на льду, чтобы предотвратить затвердевание матригели. Очистите операционное место на анестезиированном животном три раза стерильной марлей, чередуя бетадин и 70% этанола.

Накладывает стерилизованную хирургическую занавеску с отверстием три на четыре сантиметра поверх мыши и размещает хирургические инструменты автоклава поверх занавески. С помощью щипцов определите краниальный край лопатки и край грудной клетки. Держа кожу натянутой между большим и указательным пальцами хирурга, сделайте поверхностный пятмиллиметровый разрез прямо под лопаткой с помощью лезвия скальпеля размера 10.

Затем используйте 115-миллиметровые прямые ножницы, чтобы притупить рассечение подкожного жира от рёбер и межреберных мышц, не перерезая их. Чтобы остановить лёгкое кровотечение, вызванное повреждением капилляров, слегка прижимайте стерилизованный аппликатор с хлопковым наконечником к месту кровотечения. Держите разрез открытым с помощью микроадов и щипцов.

Начиная с седьмого истинного ребра, используйте изогнутые медианные щипцы, чтобы подсчитать вверх и определить четвёртое и пятое ребра. Отметьте этот регион как место инъекции. Теперь аккуратно переверните трубку подвески ячейки три-четыре раза, чтобы смешать.

Непосредственно перед инъекцией наберите 50 микролитров суспензии в стерильный 300-литровый 31-миллиметровый инсулиновый шприц, убедитесь, что нет пузырьков. Наместите полоску стерилизированной металлической ленты толщиной четыре миллиметра к шприцу, чтобы она служила пробкой и контролировала глубину инъекции. Введите 50-микролитровую суспензию под углом 90 градусов в межреберное пространство между ребрами четыре и пять прямо под четвёртым ребром и удержите иглу в положении две-три секунды.

Медленно вынимите иглу под тем же углом, что и вставлена, и выложите её в контейнер для острого изделия. Наконец, закройте разрез на коже двумя или тремя квадратными узловыми швами и нанесите ветеринарный хирургический клей на швы для укрепления закрытия раны. Биолюминесцентная визуализация выявляла сигналы, связанные с опухоли, у экспериментальных мышей уже через день после инъекции, а лучение заметно увеличивалось со временем у 25 000 и 50 000 клеток на одну мышь, при этом интенсивность наблюдалась в группе из 50 000 клеток.

Общий поток опухолей увеличился экспоненциально как в 25 000, так и в 50 000 группах клеток, достигнув более 10 раз 10 с мощностью восьми фотонов в секунду к 21-му дню в группе из 50 000 клеток. У фиктивных мышей не было выявлено люминесценции или видимой опухоли в рассекированных лёгких, тогда как у экспериментальных мышей наблюдалась высокая яркость и красные опухолевые образования в ткани лёгких. Через 21 день после инъекции у включённых мышей были выявлены опухоли, ограниченные левой долей лёгких, без инвазии в окружающие области.