Использование микроперфузии открытого потока мозга для продольного собрания интерстициальной жидкости в животной модели глиобластомы

Мы характеризуем растворимые сигнальные компоненты в интерстициальной жидкости опухоли мозга, которые способствуют прогрессированию заболевания и ответу на лечение. Оценка абсолютных концентраций растворённых веществ в интерстициальной опухоли мозга остаётся исследовательской задачей, требующей использования сложных экспериментальных методов. Для начала стерильным скальпелем сделайте сагиттальный средний разрез вдоль поверхности черепа, начиная между глазами и простираясь хвостово на 8–10 миллиметров.

Затем используйте стерильные щипцы, чтобы латерально оттягивать кожу от среднего разреза. Убедитесь, что и брегма, и лямбда видны, и при необходимости удлините разрез. Далее стерильным скальпелем разрезайте надственную область и втяните ткань в бок щипцем.

Нанесите перекись водорода от 1% до 3% с помощью стерильного аппликатора с хлопковым наконечником для очистки поверхности черепа. Теперь используйте инсулиновый шприц объемом 0,3–1,0 миллилитра, чтобы равномерно нанести 20–40 микролитров самотравящегося зубного клея на поверхность черепа. Затем подвергите его ощущающему свету, чтобы травить клей.

После высыхания уберите остатки клея стерильными аппликаторами с хлопковыми наконечниками и физиологическим раствором. Переместите сверло по координате cOFM. Установите сверло на 15 000 оборотов в минуту и просверлите отверстие для жорнов с помощью регулятора микроманипулятора DV.

Часто контролируйте толщину черепа во время бурения и промывайте физиологическим раствором физиологическим раствором для удаления мусора и снижения температуры. Повторяйте процедуру сверления на каждой точке анкерного винта. Теперь закрепите анкерные винты с помощью стерильных щипцов и стерильной отвёртки, пока не вставьте на глубину одной-двух длин резьбы.

Затем закрепите направляющую cOFM и фиктивную сборку в держатель направляющей и прикрепите держатель к стереотактической рамке. Разместите направляющий кончик выше отверстия для жорнов и медленно опускайте его до заранее заданной глубины — 1 миллиметр в минуту. Нанесите цементирующее средство на череп тонкими равномерными слоями, закрывая участки под и вокруг направляющей cOFM и винтами.

Используйте светильник для закалкивания зубов, чтобы затвердеть каждый слой перед нанесением следующего. Убедитесь, что цемент покрывает всю область между компонентами, избегая фиксирующего клина. Отсоедините держатель направляющей от направляющей cOFM и медленно поднимите его с помощью ручки DV микроманипулятора.

С помощью щипцов снимите фиксирующий клин с направляющей cOFM и фиктивной сборкой. Аккуратно вынимите манекен из направляющего. Используйте ручки микроманипулятора ML и AP, чтобы выровнять сборку инфузионной вставки шприца по направляющей cOFM.

Опустите инфузионную вставку с помощью ручки DV и закрепите её, плотно вставив запирающий клин щипцом. Теперь введите 3 микролитра суспензии клеток из шприца со скоростью 1 микролитр в минуту. Следите за зоной вокруг направляющей cOFM, чтобы убедиться, что из сборки не происходит выток подвески ячейки.

Используйте щипцы, чтобы снять фиксирующий клин с направляющей и инфузионной вставки. Затем аккуратно поднимите инфузионную вставку с направляющей с помощью ручки регулировки DV. Предварительно заполните трубки «push and pull» искусственной спинномозговой жидкостью с помощью газонепроницаемых стеклянных шприцев.

Установите перистальтическую часть трубки в головку насоса микроперфузионного насоса. Подключите мешок с перфусатом к толкающей трубке с помощью разъёма Luer. Затем подключите вставку для отбора проб к трубке с помощью фланцевых разъёмов.

Соедините более длинный впускной вал к выходному концу толкающей трубки, а более короткий выходной вал — к входному концу тяговой трубки. Поместите подключённую вставку для отбора проб в стерильную микроцентрифугную трубку с 750 микролитрами искусственной спинномозговой жидкости. Соедините стрелку сборщика фракций к выходной линии трубки с помощью фланцевого разъёма трубки.

Затем проведите промывку трубки в течение 20 минут при 10 микролитрах в минуту, чтобы устранить пузырьки воздуха. Далее предварительно заполните трубку искусственной спинномозговой жидкостью с помощью газонепроницаемых шприцев. Переустановите перистальтическую трубку в головку насоса микроперфузионного насоса.

Подключите вставку для отбора проб снова с помощью фланцевых разъёмов трубок. Подключите вход к выходному концу тяговой трубки, а выход — к входному концу трубки. Вставьте вставку в стерильную микроцентрифугную трубку с 750 микролитрами искусственной спинномозговой жидкости.

Проведите ещё одну 20-минутную систему промывки трубок со скоростью 10 микролитров в минуту, чтобы убрать остатки воздушных пузырьков. Положите анестезиированное животное в куртку подходящего размера. Полностью протяните передние конечности через проймы и надёжно пристегните куртку на спине животного.

Используйте щипцы, чтобы снять фиксирующий клин с направляющей и фиктивной конструкции. Затем аккуратно вынимите манекенную вставку из направляющей. Аккуратно вставьте вставку для отбора проб в направляющую и вставьте замыкающий клин обратно.

Выведите животное из анестезии и поместите его в вращающуюся клетку. Прикрепите трос клетки к куртке животного и активируйте вращающуюся систему клетки. После отбора cOFM отключите вращающуюся систему клетки и отсоедините трос клетки от куртки животного.

Теперь с помощью щипцов удалите фиксирующий клин с направляющей и вставка для отбора проб. Аккуратно поднимите вставку для отбора проб из направляющей, затем аккуратно вставьте фиктивную вставку обратно в направляющую и снова вставьте фиксирующий клин. Отстегните застёжки на спине куртки животного и аккуратно снимите куртку с животного.

Биолюминесцентная визуализация подтвердила наличие опухолей у животных с опосредованным cOFM-гидом опухолевых клеток. Анализ протеомных главных компонентов интерстициальной жидкости, взятой с cOFM, выявил чёткое разделение между группами животных, обработанных темозоломидом, и диметилсульфоксидом. Глобальные метаболомные сигналы почти идеально перекрывались между образцами темозоломида и диметилсульфоксида.

Несмотря на пересечение сигналов, анализ метаболомных вулканов выявил явное сдвиг, вызванный темозоломидом. Количественные сравнения метаболомных значений у тех же животных показали, что рециркулирующие конфигурации улучшают концентрацию аналитов при сохранении относительных пропорций метаболитов. Относительная доступность питательных веществ в микросреде опухоли мозга остаётся плохо изученной.

Этот протокол используется для устранения этого пробела. Характеристика доступности питательных веществ и сигнализации в микроокружении опухоли может выявить механизмы прогрессирования глиомы и адаптивную устойчивость к лечению.