Оценка терапевтических вмешательств в мышиной модели илеита и фиброза, похожего на болезнь Крона, с дефицитом SHIP

Мы используем мышей с дефицитом SHIP для изучения механизмов, вызывающих воспаление кишечника и фиброза при болезни Крона, а также для оценки новых препаратов или терапевтических стратегий для лечения болезни Крона. Поэтому мы использовали эту модель в доклинических исследованиях, чтобы показать эффективность препаратов от гликогена для таргетной доставки. Наш протокол использует мышей с дефицитом SHIP, которые естественным образом развивают воспаление и фиброз подвздошной железы, что обеспечивает более физиологически значимую модель, чем традиционные химически индуцированные или травматичные модели.

Наши результаты подтверждают, что мыши с дефицитом SHIP являются надёжной моделью воспаления и фиброза подвздошной кишки, что позволяет проводить механистические исследования и доклинические испытания терапий болезни Крона. Для начала постите мышей в течение четырёх часов перед проведением анализа. Растворите четыре килодальтона FITC-дексона в стерильной PBS до достижения конечной концентрации 80 миллиграммов на миллилитр.

Затем аккуратно фиксируйте каждую мышь и введите 150 микролитров раствора FITC-декстран через оральную гаважу, затем оставляйте мышей без еды ещё четыре часа после влива. После эвтаназии мыши проведите кардиальную пункцию с помощью иглы 25 калибра и шприца объемом 1 миллилитр для сбора крови. Немедленно добавьте 10 микролитров раствора кислоты-цитрат-декстрозы на каждые 100 микролитров собранной крови в качестве антикоагулянта.

Тщательно перемешайте, несколько раз инвертируя трубку. Центрифугуйте собранные образцы крови при 1 500 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Аккуратно перенесите плазму в маркированные микроцентрифугные трубки объёмом 1,7 миллилитра.

Держите все образцы на льду и защищённые от света, пока они не будут готовы к анализу. Теперь разведите каждый образец плазмы в соотношении один к двум и один к десяти с помощью PBS. Добавьте 100 микролитров каждого разбавления плазмы в непрозрачную пластину на 96 лунок, помещая их в дублирующие ямы.

Проведите от одного до двух последовательных разбавлений исходного FITC-декстранного бульона с объёмом 80 миллиграммов на миллилитр с использованием PBS для приготовления различных концентраций раствора. Добавьте 100 микролитров каждого разбавления в дублирующие ямы пластины на 96 лунках. Затем измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропластин, установленного на 485 нанометров для возбуждения и 535 нанометров для излучения.

После сбора крови для анализа FITC-декстран аккуратно вырежьте всю тонкую кишку мыши. Аккуратно удаляйте прикреплённые жировые и соединительные ткани из кишечника. Положите очищенный кишечник ровно на чистый лист белой бумаги, чтобы улучшить визуальный контраст.

Осмотрите ткань визуально на наличие макроскопических признаков заболевания, уделяя особое внимание дистальной части 10 сантиметров у мышей с нокаутом SHIP, где часто возникает воспаление. Выровняйте кишечник рядом с линейкой для масштаба и сфотографируйте весь образец, чтобы зафиксировать грубые патологические находки. Аккуратно промывайте просвет кишечника PBS с помощью шприца, чтобы удалить содержимое кишечника, при этом избегая чрезмерного давления, чтобы предотвратить искажение ворсинок и архитектуры крипты.

Определите область дистального подвздошного отдела, наиболее характерную для грубой патологии, и исключите примерно один сантиметр ткани. Положите вырезанную ткань ровно в гистологическую кассету и зажмите её между двумя губками, чтобы предотвратить складывание во время фиксации. Для окрашивания гематоксилином и эозином, а также трихромного окрашивания Массона фиксируйте ткань в 10% нейтральном буферном формалине, используя 10–20 раз больше объема ткани за ночь при 4 градусах Цельсия.

После фиксации переведите кассеты на 70% этанол для хранения и убедитесь, что они остаются полностью под водой до обработки. Для алцианского синего и периодического кислотного окрашивания Шиффа зафиксируйте ткань в растворе Карной на ночь при четырёх градусах Цельсия. После фиксации переведите кассеты на 100% этанол для хранения до обработки.

Затем внедрить фиксированные ткани в парафин и разрезать их на пятимикрометровые срезы для последующего окрашивания. Оценивайте подвздошные срезы с гематоксилином и эозином по 16-балльной шкале согласно определённым гистопатологическим критериям. Оцените трихромные окрашенные поперечные сечения Массона с помощью шестибалльной шкалы, основанной на заранее заданных критериях.

Вычислите итоговый балл по фиброзу как медиану баллов, присвоенных двумя независимыми рецензентами, которые не замечают экспериментальных условий. После вскрытия и удаления гистологического образца возьмите оставшуюся часть дистальной части — 10 сантиметров подвздошной кости. Промокните собранную ткань бумажным полотенцем или салфеткой без ворса, затем зафиксируйте вес ткани с помощью откалиброванной весы.

Заморозьте ткань в жидком азоте перед хранением при минус 80 градусах Цельсия для дальнейшей обработки. Когда будете готовы к обработке, доставайте замороженную ткань и всегда держите её на льду. Затем снова взвесьте образцы тканей, чтобы подтвердить точную массу.

Подготовьте буфер гомогенизации, добавив ингибитор протеазы в PBS. Используйте 10 микролитров буфера на миллиграмм ткани. Используя настольный гомогенизатор, гомогенизируйте полную толщину подвздошной ткани в ледяной гомогенизационной буфере.

Продолжайте, пока гомогенат не станет однородным и не освободится от видимых фрагментов ткани. Тщательно промывайте наконечник гомогенизатора PBS между образцами, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение. Центрифугуйте ткань при 10 000 G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

Аликвот очищающие супернатанты разделяют на меньшие объёмы, чтобы предотвратить циклы замораживания и оттаивания, затем храните их при минус 80 градусах Цельсия для дальнейшего анализа. Гистологический анализ показал значительно большее повреждение кишечника у мышей с дефицитом SHIP по сравнению с контролем SHIP. Лечение дексаметазоном снижало гистологические повреждения у мышей с дефицитом SHIP, хотя это снижение статистически не было значимым.

Трихромное окрашивание Массона показало значительное увеличение отложения коллагена у мышей с дефицитом SHIP по сравнению с контролем SHIP, что указывает на более высокие показатели по фиброзу. Лечение дексаметазоном значительно снизило фиброз у мышей с дефицитом SHIP, приблизив показатели к контрольным группам положительных по SHIP. Alcian blue и PAS окрашивание подтвердили гиперплазия кубочных клеток у мышей с дефицитом SHIP, которая заметно снизилась после лечения дексаметазоном.

Концентрации бета-IL-1 были значительно повышены у мышей с дефицитом SHIP по сравнению с контролем SHIP. Дексаметазон значительно снизил концентрацию IL-1beta у мышей с дефицитом SHIP. Концентрации MPO были значительно повышены у мышей с дефицитом SHIP по сравнению с контролем SHIP, и этот рост был снижен дексаметазоном без достижения статистической значимости.

Концентрации LCN-2 также были повышены у мышей с дефицитом SHIP, но высокие значения не были стабильно снижены дексаметазоном. Концентрации бета-IL-1 положительно коррелировали с гистологическими повреждениями и показателями фиброза, что указывает на связь между воспалениям и повреждением тканей. Гистологические показатели повреждений положительно коррелировали с показателями фиброза, что свидетельствует о том, что повреждение тканей и фиброзная ремоделирование развивались параллельно.