Модель мыши для микроваскулярной эмболии для двухфотонной микроскопии in vivo с использованием флуоресцентных полистироловых микросфер
21 ноября 2025 г.
Этот протокол содержит подробное описание пошагового подхода к модели мыши с хроническим окном черепа и микроваскулярной эмболии, оптимизированной для in vivo двухфотонной микроскопии с использованием флуоресцентных полистироловых микросфер.
Используя этот метод инъекции микросферы, мы стремимся выявить краткосрочные и долгосрочные последствия закупорки капилляров, чтобы изучить возможные механизмы очищения эмбола в сети капилляров мозга. Он позволяет осуществлять в реальном времени in vivo визуализацию и отслеживание флуоресцентных частиц в корковой капиллярной сети. Микросферы и локальные последствия можно отслеживать в течение нескольких недель после инъекции.
Наши исследования помогают понять локальное повреждение тканей, вызванное микрососудистыми окклюзиями. Эти результаты, надеемся, приведут к появлению новых методов лечения. Теперь мы можем ежедневно и неделями изучать, как закупорка капилляров изменяет сосуды, активирует клетки, меняет кровоток и повреждает гематоэнцефалический барьер.
Для начала зажмите палец ноги у анестезиированной мыши, чтобы проверить глубину анестезии. Сделайте разрез по средней линии примерно 0,5 сантиметра над трахеей ниже нижней челюсти с помощью хирургических ножниц и вскрытия щипцов. Вскрытие соединительной ткани, поверхностной к шейной фасции, с помощью микрошовных щипцов, обнажающих подъязычные мышцы грудины.
Теперь разделите левую и правую грудинные подъязычные мышцы, аккуратно разорвав соединительную ткань между ними. Втяните правую омогиоидную мышцу каудально-латерально с помощью тканевого крючка. Убедитесь, что правый сонный треугольник, включая общую сонную артерию, внутреннюю сонную артерию и внешнюю сонную артерию, хорошо виден.
Далее удалите всю оставшуюся фасцию и жировую ткань вокруг общей сонной артерии. Аккуратно отдельте общую сонную артерию от блуждающего нерва. Наместите две нити 4/0 1.5 вокруг общей сонной артерии и свободно завяжите их, чтобы узлы не мешали кровотоку.
Удалять фасцию и жировую ткань из внутренней сонной артерии и задней теменной артерии. Затем временно перевязать заднюю теменную артерию и все внутренние боковые ветви, включая затылочную, завязывая узел нитью 4/0 1,5. Удалите фасцию и жировую ткань из наружной сонной артерии и височной артерии.
Наместите два свободных узла вокруг внешней сонной артерии и височной артерии с помощью ниток размера 4/0 1.5. Разместите самую дистальную нить как можно дальше от Y-образной бифуркации и используйте её для постоянного связывания внешней сонной и височной артерии. Оставьте проксимальный узел развязанным.
Гомогенизировать и сониковать микросферы размером 10 микрометров для получения равномерной суспензии отдельных частиц. Добавьте 20 микролитров гомогенизированных микросфер к 140 микролитрам FITC-Dexn, чтобы получить итоговый объём 160 микролитров смеси, содержащей 1,44 умножить на 10 к мощности пяти микросфер. Кратко уберите шприц, подключённый к катетеру, чтобы создать шлюз.
Затем окуните наконечник катетера в подготовленную смесь FITC-Dextran/Tween20/микросферы и медленно оттягивайте шприц назад, пока смесь не попадёт в катетер. Убедитесь, что в катетере нет воздушных пузырьков. Поместите шприц с загруженным катетером в насос для шприца.
Установите насос на 10 микролитров в минуту и работайте, пока на кончике катетера не появится небольшая капля микросферной смеси. Теперь установите зажим сосудов на внутреннюю сонную артерию и затяните один из ранее подготовленных проксимальных узлов вокруг общей сонной артерии. С помощью микроножниц сделайте небольшой диагональный разрез во внешней сонной артерии примерно в 0,5 миллиметра от нити для перевязки, чтобы размер разреза был немного меньше диаметра катетера.
Впитывайте всю кровь стерильной тканью. Кратко запустите насос шприца, чтобы получить каплю микросферной смеси на кончике катетера, убедившись, что воздух в кончике катетера не осталось. Откройте наружный разрез сонной артерии и введите катетер с помощью мелких микрощипцев.
Затем закрепите катетер во внешней сонной артерии, затянув проксимальный шов вокруг внешней сонной артерии. Постепенно сцеживайте со скоростью 10 микролитров в минуту, пока артерия заметно не увеличится, а зелёный краситель FITC не заполнит наружную сонную артерию, что подтвердит успешную инъекцию. Далее удалите зажим сосуда из внутренней сонной артерии.
Затем увеличьте расход насоса шприца до 20 микролитров в минуту. Подтвердите успешную инъекцию в микросферу, убедившись, что внутренняя сонная артерия, расположенная дистально от задней теменной артерии, заполнена красителем FITC. После успешной инъекции удалите нить, связывающую общую сонную артерию, чтобы микросферная смесь могла поступать во внутреннюю сонную артерию.
Во время инъекции краситель FITC всё ещё можно наблюдать во внешней сонной артерии. Выключите насос для шприца, когда смесь в катетере достигнет отметки в 80 микролитров, чтобы остановить инъекцию. Затем перевязывайте общую сонную артерию, обрежайте внутреннюю сонную артерию и аккуратно удалите катетер, сохраняя фиксирующую нить на месте.
Навсегда перевязывайте наружную сонную артерию, затянув нить, закреплявшую катетер. Удалите клипс и нитки сосудов вокруг общей сонной артерии, внутренней сонной артерии и задней теменной артерии, чтобы восстановить кровоток. Успех операции по удалению микрососудистой эмболии был подтверждён посмертным снимком на месте всего тела и мозга через четыре дня после операции.
Сагиттальный срез мозга показал наличие микросфер в мозге. Извлеченные мозги мышей, полученные на следующий день после операции, показали, что микросферы преимущественно застряли в ипсилатеральном полушарии, в области потока средней и передней артерий мозга. Количество микросфер в срезах мозга значительно увеличилось при добавлении Tween20 в микросферную смесь.
Мыши теряли меньше веса и быстрее восстанавливались после операции при введении микросферной смеси, содержащей Tween20. Флуоресцентные микроскопические изображения коры мозга, сделанные через 0,5 часа после операции, показали отдельные белые точки, представляющие микросферы, блокирующие капилляры. Двухфотонные Z-стековые изображения показали микросферы, вызывающие церебральные микрососудистые эмболии с нарушением перфузии.
Эмболии также вызывают нарушение гематоэнцефалического барьера с заметной утечкой красителя из сосудов.
Обзор
В данном протоколе подробно описывается пошаговый подход к созданию мышиной модели с хроническим краниальным окном и микрососудистой эмболией, оптимизированной для двухфотонной микроскопии in vivo. Метод предполагает использование флуоресцентных полистирольных микросфер для исследования эффектов закупорки капилляров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Микрососудистые исследования
- Методы визуализации in vivo
Теоретические основы
- Понимание последствий микрососудистых окклюзий имеет решающее значение для разработки новых стратегий лечения.
- Визуализация в режиме реального времени позволяет отслеживать флуоресцентные частицы в сети церебральных капилляров.
- Предыдущие исследования показали, что закупорка капилляров может привести к локальному повреждению тканей.
- Данное исследование направлено на выяснение механизмов элиминации эмболов в головном мозге.
Цель исследования
- Исследование краткосрочных и долгосрочных эффектов закупорки капилляров.
- Изучение влияния микрососудистых окклюзий на кровоток и гематоэнцефалический барьер.
- Поиск потенциальных стратегий лечения состояний, связанных с повреждением микрососудов.
Используемые методы
- Создание хронического краниального окна у мышей для визуализации.
- Инъекция флуоресцентных микросфер для индукции микрососудистой эмболии.
- Использование двухфотонной микроскопии для визуализации в режиме реального времени.
- Послеоперационная визуализация для подтверждения локализации микросфер в головном мозге.
Основные результаты
- Микросферы преимущественно локализовались в ипсилатеральном полушарии.
- При добавлении Tween20 наблюдалось увеличение количества микросфер.
- Мыши, которым вводили Tween20, демонстрировали более быстрое восстановление после операции.
- Флуоресцентная микроскопия выявила окклюзию капилляров микросферами.
Выводы
- Данный метод позволяет детально изучать окклюзии микрососудов in vivo.
- Полученные результаты могут привести к новым представлениям о стратегиях лечения микрососудистых заболеваний головного мозга.
- Исследование расширяет понимание динамики кровотока и повреждения тканей головного мозга.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Модели микрососудистой эмболии с использованием флуоресцентных микросфер и двухфотонной микроскопии in vivo представляют собой надежную платформу для изучения механизмов и последствий микроокклюзий головного мозга. Данный подход обеспечивает высокоразрешающее лонгитюдное отслеживание сосудистых событий и тканевых реакций, что повышает прогностическую достоверность при валидации нейроваскулярных мишеней на ранних стадиях. Воспроизводимость модели и количественные данные визуализации делают ее ценным инструментом для приоритизации портфеля препаратов и снижения механистических рисков в процессе разработки нейроваскулярных лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Позволяет проверять гипотезы о нейроваскулярных повреждениях путем контролируемого индуцирования микроокклюзий.
- Обеспечивает механизм снижения рисков за счет визуализации реакций сосудов, клеток и гематоэнцефалического барьера в динамике.
- Способствует функциональной валидации мишеней путем установления связи между событиями эмболии, последующим повреждением тканей и динамикой клиренса.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для количественной оценки микрососудистой окклюзии и реперфузии.
- Предоставляет воспроизводимые результаты высококонтентной визуализации, подходящие для стандартизации анализа и сравнения данных между исследованиями.
- Позволяет проводить скрининг потенциальных методов терапии, направленных на устранение эмболии или нейроваскулярную защиту.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям повреждения церебральных микрососудов при заболеваниях для трансляционного поиска биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет возможности лонгитюдного отслеживания результатов.
- Обосновывает решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем количественной оценки тканевых и сосудистых реакций на микроокклюзии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, связывая механистические исследования и трансляционную медицину в области нейроваскулярной биологии.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез о механизмах микрососудистого повреждения и клиренса с помощью визуализации в реальном времени.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных, воспроизводимых данных для оценки потенциальных терапевтических средств in vivo.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение степени эмболии, повреждения тканей и восстановления в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: связывают механистические выводы с клинически значимыми конечными точками заболевания и разработкой биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированную, многократно используемую платформу для нейроваскулярных исследований и тестирования методов медицинского вмешательства.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность при валидации нейроваскулярных мишеней и снижении механистических рисков.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет стандартизированных протоколов визуализации и инъекций.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет предоставления количественных лонгитюдных данных о состоянии сосудов и тканей.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию нейроваскулярных программ с поправкой на риск на основе надежных данных in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии, визуализации in vivo и количественного анализа сосудистых событий.
- Необходим доступ к двухфотонному микроскопу и инфраструктуре для трехмерной визуализации post-mortem.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация составов инъекционных смесей и протоколов визуализации.
- Метод применим к различным моделям мышей, однако может потребоваться оптимизация для разных сосудистых территорий.
- Потенциальные ограничения включают техническую сложность и необходимость продольного мониторинга животных.
