Аэробные испытания материалов на биоразложение с использованием натурального морского инокулюма морской воды и респирометра замкнутого цикла

Наши исследования количественно оценивают скорость аэробной биодеградации и степень содержания природных материалов в морской среде с использованием природного инокуля морской воды для сравнения данных. Наши текущие экспериментальные задачи включают ограниченные возможности по тестированию и отсутствие инфраструктуры для удовлетворения растущего спроса на биодеградационные испытания, при этом обеспечивая единообразные и прозрачные методы в лабораториях. Для начала соберите от 10 до 20 литров морской воды в 20-литровый выщелачиваемый кислотой карбой с помощью большой бутылки Niskin.

Транспортируйте заполненный вагончик обратно в лабораторию. Перелите один литр цельной морской воды из карбоя в кислотно-выщелаченную бутылку с янтарным HDPE объемом один литр для анализа частиц углерода и азота. Профильтруйте её через мембрану с низким содержанием азота и целлюлозным ацетатом толщиной 0,2 микрома.

Теперь наполните объёмную колбу на один, два или четыре литра наполовину морской водой. Если в морской воде содержатся органические вещества с высоким содержанием частиц, просейте её через 20-микрометровую сетку, чтобы удалить крупные гетерогенные частицы. Затем соберите 60 миллилитров фильтрата в кислотно-выщелаченную полиэтиленовую бутылку для анализа растворённого неорганического и органического азота и фосфора.

Свободно закройте отверстие в карбой, чтобы обеспечить аэробные условия. Храните в темноте при 30 градусах Цельсия до семи дней. Затем поместите 10–15 граммов экспериментального субстрата в 50-миллилитровую банку для нержавеющей стали.

С 20-миллиметровым стальным шаром. Погрузите мельничную банку в жидкий азот на 15 минут, чтобы она стала хрупкой. Закрепите банку для фрезера в креплении шарового фрезера.

Затем установите прибор на 30 герц и две минуты 30 секунд и нажмите старт. Проведите помол четыре раза с 30 секундами охлаждения в жидком азоте между циклами. До начала испытания измельчите подложку до равномерного размера частиц от 0,10 до 0,25 миллиметра.

Используя точный вес с чувствительностью 0,001 грамма, взвесьте 0,5 грамма на литр хлорида аммония и 0,1 грамма на литр моноосновного калия фосфата. Добавьте неорганические питательные вещества в колбу. Доведите объём до маркировки с помощью морской воды.

Затем положите в батончик для перемешивания и перемешайте на тарелке, пока все соли не растворятся. На аналитических весах взвесьте 20 миллиграммов экспериментального или контрольного субстрата. Запишите весь вес показаний и отложите флакон в сторону.

Для установки реакторных сосудов используйте кислотно-выщелаченную объёмную пипетку объёмом 75 миллилитров с моторизованным контроллером пипетки и аспирируют морскую воду, чтобы ввести 75 миллилитров питательной воды в каждый реакторный корпус. Удалите примерно три миллилитра морской воды с каждого судна. Затем положите её на чистую поверхность рядом с сосудом, чтобы промыть измельчённый субстрат с разорванного флакона.

Теперь переместите обработанный субстрат в соответствующий реакторный корпус из разорванного флакона. Поставьте уплотнительное кольцо на край корпуса реактора. Затем накройте двухпортовую крышку на уплотнительное кольцо и закрепите винтовой крышкой.

Подключите каждый реакторный корпус к соответствующим газовым или конденсационным линиям. Плотно вставьте газовые трубы в соответствующие входные и выходные отверстия крышки. Включите платформу шейкера на 0.05G в непрерывном режиме.

Визуально убедитесь, что все сосуды надёжны, затем закройте дверцы инкубатора. В инструментальном программном обеспечении перейдите в Эксперимент и нажмите Настройка. Введите номера начальных и конечных каналов из выпадающего меню, соответствующих занятым каналам.

Установите порог обновления на 0.50. Интервал обновления на NA и обновление окна на Auto. Затем поставьте галочку для датчиков продувки в разделе «Разная настройка».

Убедитесь, что не выбраны параметры авто-измерения объёма, положительный расход кислорода и режим открытого потока. Установите интервал выборки на 8.00. Затем настройте единицы газа и времени по мере необходимости.

Если используете первичный температурный датчик для коррекции температуры инкубации, убедитесь, что не выбран режим ручного ввода температуры камеры. Отметьте галочку для режима вентиляции и убедитесь, что режим слива не выбран. Теперь выберите Настройка камеры и введите описательные метки каналов.

Если указана утечка, убедитесь, что уплотнительное кольцо чистое, расположено и свободно от частиц или волокон. Затяните крышку винта. Осмотрите соединения труб на входе и выходе.

Обрежьте изношенные или деформированные концы трубок острым лезвием для создания чистых порезов. В меню выберите «Инструменты», затем нажмите «Сервисное меню» и убедитесь, что основной температурный датчик измеряет 30 градусов Цельсия с двумя вариациями и стабилен. Нажмите «Запустить», чтобы начать эксперимент.

Сохраните файл эксперимента под описательным именем, включая дату, и запишите имя файла в технический лист. Совокупное производство углекислого газа за 84 дня подтвердило ожидаемые показатели. За 84 дня целлюлоза показала быстрое выработку углекислого газа после короткой задержки и достигла около 700 микромолей.

PHA показал более медленный начальный темп в течение трёх дней. Контроль морской воды оставался низким — 150 микромолей. Индивидуальные отрицательные контрольные репликаты показали низкую вариабельность, при этом все кривые оставались близко друг к другу.

Контрольные репликаты с положительным результатом целлюлозы демонстрировали стабильно низкую вариабельность, что подтверждает стабильную работу по всем четырём репликам. В наборе данных с отрицательным результатом реплика пять показала аномальный скачок выработки углекислого газа, вероятно, вызванный лабильным органическим веществом, но его совокупное производство начало застывать на уровне 100 микромолей. Реплика одной из шести имела меньший кумулятивный выброс углекислого газа по сравнению с другими, что указывает на возможные технические проблемы.

Стандартная ошибка среднего кумулятивного образования углекислого газа в отрицательном контроле составляла 2,5%, что указывает на низкую вариабельность между репликатами. Стандартная ошибка для контрольной группы положительной целлюлозы составила 0,83%, что дополнительно подтверждает высокую воспроизводимость биодеградационного теста. PHA обладает высокой минерализацией, близкой к положительному контролю, со стандартной ошибкой, сопоставимой с контрольной.

Этот протокол устраняет пробел в стандартизированных доступных методах скрининга биоразлагаемости материалов в морской среде для промышленности, академических кругов и регулирующих органов. Протокол обеспечивает более быстрый стандартизированный способ прямого измерения этой биодеградации с более короткой продолжительностью тестирования при одновременной оценке образцов. Протокол обеспечивает высокопроизводительное стандартизированное тестирование для сопоставимости материалов и лабораторий для машинного обучения и предиктивного моделирования производительности материалов.