Стандартизированный рабочий процесс SDS-PAGE для персонализированного профилирования белковой короны в раннем выявлении рака

Мы изучаем, как наночастицы взаимодействуют с кровью, чтобы выявлять ранние признаки рака, стремясь к простому воспроизводимому и преимущественно неинвазивному диагностическому тесту. Для начала разведите раствор нанолистов оксида графена объёмом четыре миллиграмма на миллилитр в сверхчистой воде до нужной концентрации. Соникировать разбавленный раствор в течение двух минут при амплитуде 28%, с импульсной установкой восемь секунд включённым и отключением шесть секунд для равномерного распределения.

Количественно определить концентрацию дисперсного раствора с помощью ультрафиолетовой видимой спектроскопии. Затем измерьте гидродинамический размер и зета-потенциал раствора с помощью динамического рассеяния света с помощью гелиевого неонового лазера диаметром 633 нанота. Разведите образец в сверхчистой воде в соответствии с пределами обнаружения QVet.

Далее разведите коммерческую лиофилизированную человеческую плазму сверхчистой водой по мере необходимости. Центрифугуйте восстановленную плазму при 18 620 G в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Соберите супернатант и храните при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования.

Теперь измерите концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту, чтобы скорректировать разбавление плазмы и определить оптимальное соотношение наночастиц к плазме. Смешайте выбранный объём наночастиц с плазмой, чтобы получить целевое соотношение между ними. Инкубировать смесь при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.

Для выделения белковой короны центрифугуйте образцы плазмы наночастиц при температуре 18 620 G при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут. Промой полученную гранулу 200 микролитрами сверхчистой воды. Затем подвесьте его и снова центрифугайте.

После окончательной промывки подтверждение наличия компактной гранулы как доказательства изоляции белкового комплекса наночастиц. Далее смешайте восстановительный агент, буфер для загрузки и воду, чтобы достичь рассчитанного объема буфера нагрузки. Подвесьте пулю в подготовленном буфере для загрузки.

Затем прокипятите суспензию при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут. Центрифугуйте кипяченный образец при 18 620 г при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут. Соберите супернатант в новую трубку.

Теперь подготовьте белковую лестницу, разбавляя стандарт молекулярной массы в неокрашенном буфере с окрашенным буфером. Разбавьте 10 x Tris-Glycine-SDS буфер до одной x концентрации. Собрать камеру электрофореза с помощью геля без градиентов от четырёх до 20%.

Затем заливайте буфер, пока он не достигнет рекомендованного производителя уровня. Загрузите 10 микролитров образца в каждую скважину. Затем пипетить семь микролитров лестницы в каждую яму.

Пусть гель будет под напряжением 150 вольт примерно 90 минут при комнатной температуре. Храните образ геля в виде tiff-файла в той же папке, что и скрипты. Затем открытая гелевая обработка.

m в MATLAB. Введите название гелевого изображения в качестве названия. Затем введите индекс одной лестничной дорожки в качестве индексного маркера.

Запусти сценарий. Выполнение шагов будет отмечено в окне команд, и на экране появятся четыре окна. Теперь откройте первую фигуру с оригинальным гелевым изображением сверху и его коррекцией для эффекта косой дорожки внизу.

Измените значения коррекции левой и правой коррекции, чтобы настроить параметры коррекции. Откройте фигуру два. Он содержит изображение, скорректированное для эффекта наклонной полосы сверху, и изображение с удаленным фоном внизу.

Отрегулировать значение BKG par X в скрипте для настройки удаления фона. Обратите внимание, что все идентифицированные полосы обозначены вертикальными белыми линиями на рисунке два. Теперь откройте рисунок три, содержащий профиль интенсивности маркерной полосы с обнаруженными пиками слева и нелинейным подгоном с R-квадратом справа.

Проверьте, что количество ожидаемых полос на лестничной линии совпадает с количеством обнаруженных пиков, используемых для процедуры подгонки. Затем откройте рисунок четыре с нормализованными профилями интенсивности для всех обнаруженных полос в геле. Установить параметр экспорта на один, чтобы профили интенсивности экспортировали как функции молекулярных масс в файле Excel.

Запусти сценарий. После завершения в рабочей папке будет сформирован лист Excel, содержащий абсолютные и нормализованные профили как функции молекулярной массы в первом столбце. Затем откройте файл Gel Profiles Pro M и запустите скрипт.

На экране появятся четыре окна. Откройте рисунок пять, содержащий профили абсолютной интенсивности в верхней части и соответствующие общие интенсивности внизу для каждой дорожки. И рисунок шесть, содержащий нормированные профили интенсивности для каждой полосы.

Ось молекулярной массы делится по диапазонам, указанным как reg в скрипте. Установите данные экспорта на единицу, чтобы экспортировать абсолютные и нормализованные интегральные области. Запусти сценарий.

После завершения в рабочей папке будет сформирована электронная таблица, содержащая экспортированные абсолютные и нормированные области в указанных диапазонах молекулярных масс. Наконец, откройте фигуру семь и восемь. Они содержат гистограмму абсолютных и нормализованных областей для каждой полосы, сгруппированных соответственно по полосам и площади.

Представленный здесь протокол устанавливает стандартизированный и воспроизводимый рабочий процесс для выделения и характеристики белковой короны, образованной на наночастицах после инкубации с плазмой. Этот метод обеспечивает высокосогласованные профили страниц SDS, способные фиксировать биологически значимые и диагностически значимые характеристики каждой персонализированной короны. Профили страниц SDS, полученные во всех условиях, были высоковоспроизводимыми.

Повышение концентраций в плазме с 5% до 50% приводило к более высокой интенсивности сигнала в области 30–80 килодальтонов профилей страниц SDS. Автоматизированный процесс пипетирования дал практически идентичные электрофоретические профили. Оксид графена стабильно обеспечивал хорошо разрешённые стабильные коронные профили, обусловленные его высокой площадью поверхности и заряженными свойствами.

Размерные распределения малых, средних и крупных образцов оксида графена были узкими, не перекрывающимися и сосредоточены примерно в 100, 300 и 750 нанометрах соответственно. Профили SDS-страниц белковых корон, образованных на оксиде графена, были схожи по размеру. Хотя наблюдались заметные различия между различными разбавлениями, более низкие концентрации плазмы приводили к более интенсивным полосам в удельных молекулярных диапазонах, что указывает на селективное обогащение белка.

При промежуточных разбавлениях плазмы профили плотностных метрик выявляли различия, специфичные для заболевания, особенно в области 20–30 килодальтон, где образцы PDAC демонстрировали сниженную интенсивность сигнала. Одна только модель профилирования на основе страниц SDS правильно идентифицировала как PDAC, так и контрольные образцы с точностью 83% и сбалансированной чувствительностью и специфичностью. Комбинированная диагностическая модель, включающая профили короны SDS страницы и уровни CA 19–9, обеспечивает наивысшую точность, чувствительность и специфичность при классификации пациентов с PDAC.

Мы используем автоматизированные рабочие процессы, нетехнологические методы и инструменты на базе искусственного интеллекта для продвижения исследований диагностики рака. Наш протокол быстрый, удобный для пользователя и соответствует требованиям ВОЗ, обеспечивая стандартизированные воспроизводимые отпечатки белков короны с высокой диагностической значимостью.