Изучение применения поверхностно-усиленного рамановского биосенсорирования отдельных sEV в диагностике и терапии заболеваний

Мы используем поверхностное рамановское рассеяние в сочетании с машинным обучением для ранней диагностики рака, а также для реализации биомедицинских приложений. Ключевой экспериментальной проблемой является врождённая гетерогенность экзосомных образцов — высокосложных, высокоразмерных спектроскопических данных, что усугубляется низким отношением сигнал/шум. Для начала пипеткой нанесите примерно пять микролитров образца малого внеклеточного везикула на выделенный плазмонный субстрат.

Поместите субстрат в осушитель, чтобы капля полностью высохла примерно на 15 минут. Затем перенесите засохший субстрат в конфокальный рамановый микроскоп. Используя инструментальное программное обеспечение WiRE версии 4.4, запустите сбор данных.

Установите возбуждающий лазер на 785 нанометров при мощности пять милливатт и откалибруйте систему. Для получения спектров из золотого субстрата проведите скаутское сканирование площади 300 на 300 микрометров, чтобы найти отдельные везикулы в статическом режиме с шагом 10 микрометров, экспозицией 0,1 секунды и мощностью 50% лазера. После обнаружения везикул проводите картографирование высокого разрешения в статическом режиме в сетке пять на пять с использованием шага размером одного микрометра, экспозиции 0,2 секунды на точку и мощности лазера 50%.

Далее получите спектры с графеновой подложки, выполнив следующие сканирования. Откройте начальные необработанные спектры и исключите те, что демонстрируют чрезмерный шум или аномальные спектральные формы. Примените фильтр Савицк-Голея к каждому спектру для уменьшения фона флуоресценции и сглаживания спектральных данных.

Вычислите отношение сигнал/шум для каждого спектра с помощью метода пик к базовой линии или стандартного метода отклонения. Для каждого спектра вычислите отношение сигнал/шум как отношение пиковой интенсивности после базового вычитания в репрезентативной рамановской зоне к стандартному отклонению шума. Оценить шум, вычитая сглаженную версию спектра по Савицкому-Голею, используя окно размера 11 и полиномиального порядка три из исходного спектра.

Ранжуйте все спектры по возрастающему порядку отношения сигнал/шум и оценивайте сохраняемость диагностических пиков в ранжированных спектрах для определения порога. Затем установите порог в точке, когда любой из этих пиков исчезает в базовый шум, соответствующий соотношению сигнал/шум 28. Исключать спектры, которые ниже порога соотношения сигнал/шум — 28, чтобы обеспечить сохранение только спектров высокого качества для дальнейшего анализа.

И нормализовать каждый оставшийся спектр либо до максимальной пиковой интенсивности, либо до общей площади под кривой. Назначьте метку каждому спектральному измерению на основе его происхождения, например, пациенту с раком желудка или здоровой контрольной группе. Введите помеченные спектральные данные в классификатор поддерживающего вектора с линейным ядром и применяйте стратифицированное разбиение для пятикратной перекрестной валидации, чтобы обеспечить сбалансированное представление в каждом складке.

Теперь усредняйте метрики точности по всем компонентам, чтобы оценить общую производительность модели. Наконец, используйте линейный дискриминантный анализ (LDA) для уменьшения размерности поверхностно-усиленного рамана-рассеяния данных для визуализации. Использовать обученную модель линейного дискриминантного анализа для прямой классификации между выборочными группами.

Рамановские спектры с соответствующими средними спектрами выявили отличительные молекулярные сигнатуры для каждого типа образца, полученных из отдельных малых внеклеточных везикул, выделенных из образцов ткани, крови и слюны. Линейный дискриминантный анализ выявил чёткое кластерирование данных о внеклеточных везикулах в зависимости от их исходной ткани, крови или слюны. Бинарная классификация с использованием машинного классификатора поддерживающих векторов достигает наивысшей точности для образцов тканей — 90,1%, затем крови — 70,9% и слюны — 60,7% LDA, чётко разделяя здоровые и плоды рака желудка в тканевых внеклеточных везикулных данных.

Аналогичные классификационные разделы на основе LDA для данных из внеклеточных везикул из крови и слюны показали менее оптимальное разделение между здоровыми и раковыми образцами. Рамановские спектры инкубированных доксорубицинов пузырьков без графена показали стабильные пики примерно 1 081, 1, 206 и 1 440 инверсивных сантиметров. С графеном были зафиксированы дополнительный пик D примерно 1350 инверсных сантиметров и пик G примерно 1 580 инверсных сантиметров, служащие внутренними стандартами.

Отношение пика доксорубицина на 442 инверсных сантиметра к пику графена G увеличивалось с увеличением концентрации лекарств и увеличением времени инкубации. Мы установили единый биохимический отпечаток везикул для выявления источников заболеваний, показывающих потенциал для ранней диагностики. Три ключевых преимущества нашей техники.

Во-первых, он очень чувствительный. Во-вторых, это неинвазивно. и в-третьих, он не требует лизирования или физического расщепления частиц.

В будущем мы будем коррелировать спектральный профиль с протеомным профилем, что, в свою очередь, поможет коррелировать содержание экзомов с конкретными функциями, такими как клеточная коммуникация и транспортировка.