Амилоид и кросс-бета-архитектура

Наши исследования используют дифракцию рентгеновских волокон для изучения структуры кросс-бета-амилоидных фибрилл и её молекулярной организации. Этот протокол использует рентгеновскую дифракцию волокон для подтверждения кросс-бета-паттернов и разъяснения архитектуры фибрилл. Этот протокол позволяет проводить структурный анализ амилоидных фибрилл от подтверждения кросс-бета-организации до уточнения дополнительных молекулярных деталей.

Для начала выровняйте белки или пептидные фибриллы так, чтобы получить пучок, оси волокна, в идеале, все параллельны. Растопите воск для свечи на горячей тарелке, пока он не станет жидким. Используя стеклорез, вырежьте боросиликатные стеклянные капилляры длиной около 2-3 сантиметров длиной 1 миллиметра.

Ненадолго окуньте разрезанные капилляры в жидкий воск. Затем капиллярным действием поднимают воск свечи примерно на 1-2 миллиметра внутри капилляра. Теперь используйте пластилин, чтобы горизонтально закрепить герметичные капилляры внутри чашки Петри.

Сохраняйте зазор в 0,5–2 миллиметра между восковыми концами капилляров. С помощью пипетки аккуратно подвесите 10-микролитровую каплю фибриллового раствора между восковыми концами двух капилляров. Накройте чашку Петри, чтобы защитить образец от пыли, и дайте испариться на ночь.

Затем запечатайте пластину, чтобы поддерживать контролируемую атмосферу сушки. Чтобы выровнять амилоидные фибриллы в стеклянном капилляре, закрепите шприц диаметром 1 миллилитр с резиновой трубкой к широкому концу капилляра кремнизирующего стекла диаметром 0,7 миллиметра. Введите 2-3 сантиметра фибрильной суспензии в капилляр.

Герметизируйте один конец капилляра расплавленным воском, а другой оставьте открытым для испарения. Расположите капилляр вертикально и дайте ему высохнуть до образования засохшего диска. Чтобы выровнять фибриллы в виде коврика или тонкой плёнки, поместите образец фибрилли высокой концентрации на стеклянный стекло и накройте его перед сушкой на воздухе на 24 часа.

Аккуратно закрепите приклад фибрилового расслоения на гониометрическую головку и ориентируйте его так, чтобы рентгеновский пучок проходил через расслоение. Если использовать образец фибрилового мата, ориентируйте его так, чтобы рентгеновский пучок проходил сквозь край коврика. Осмотрите образец под световым микроскопом с перекрестным поляризатором для наблюдения двупреломления.

Разместить образец в рентгеновском пучке в зависимости от того, является ли он волокнистым пучком, ковриком или диском. Собирайте дифракционную картину с помощью собственного рентгеновского оборудования или синхротронного излучения. Для анализа данных загрузите файл в программное обеспечение для анализа дифракционных паттернов CLEARER.

Перейдите в Дифракционный паттерн и Дифракционные настройки, чтобы ввести дифракционные настройки, включая размер пикселя, источник рентгеновского излучения и расстояние от образца до детектора. Нажмите на «Обработка изображения» и «Поворот», чтобы повернуть дифракционное изображение так, чтобы меридиан был вертикальным. Используйте модуль центрирования, перейдя в раздел «Дифракционный паттерн» и кликнув на «Центральное изображение», чтобы центрировать изображение.

Определите ось меридиана и экватора. Сохраните центрированное изображение для дальнейшего анализа. Далее закажите подходящий угол вдоль меридиана и экватора.

Нажмите «Дифракционный паттерн», а затем модуль «Радиальное усреднённое», чтобы создать график положения дифракционного сигнала. против интенсивности. Перейдите в модуль Peak Find из меню дифракционной картины, чтобы измерить и автоматически вывести дифракционный сигнал.

Отрегулировать ширину пикового поиска, чтобы обнаруживать истинные сигналы без шума. Используйте опцию увеличения и измерения, чтобы проверить положение дифракционного сигнала с помощью поиска пика. Изучите размеры потенциальных элементарных ячеек с помощью модуля оптимизации элементарных ячеек.

Вводите начальные оценки на основе сильных экваториальных сигналов и определяйте минимальный и максимальный индексы для поиска по ячейкам. Рассчитать размеры потенциальных единичных ячеек и сравнить предсказанные положения дифракционных сигналов с наблюдаемыми отражениями. Выберите элементарную ячейку, которая лучше всего подходит для данных и выборки.

Для построения молекулярных моделей постройте 3D-расположение пептидов в бета-листовой конфигурации, подходящей к определённой элементарной ячейке. Убедитесь, что все компоненты, связанные с симметрией, включены. Далее нажмите на «Дифракционное симуляционное моделирование», затем «Генератор цепей структур и конструкций» и загрузите модель PDB.

Назначьте ось волокна и ось балки, входные размеры элемента и затем проверьте наличие стерических столкновений. Перейдите в Diffraction Simulation и нажмите Fiber Diffraction Simulation, чтобы загрузить координаты PDB в модуль Fiber Diffraction Simulation. Введите направление оси волокна, ориентацию пучка, размеры элементарных элементов, настройки источника и детектора рентгеновского излучения, затем нажмите «Симулировать» для запуска симуляции.

Убедитесь, что ось балки перпендикулярна оси волокна. Затем перейдите в раздел «Файл» и нажмите «Сохранить как», чтобы сохранить настройки симуляции в виде html-файлов для последующего редактирования. Сохраните симулированный дифракционный паттерн в формате RAW или в формате TIFF.

Сравните смоделированную картину с экспериментальной дифракционной картиной. Измерять симулированные дифракционные сигналы с помощью того же процесса анализа. Записывайте и сравнивайте эти значения с экспериментальными данными.

Электронные микрофотографии показали высокую плотность амилоидных фибрилл на сетке, подходящую для подготовки образца рентгеновского волокна. Волокна, выровненные по стретч-каркасу, создали характерную кросс-бета-дифракционную картину с меридиановым отражением на 4,76 ангстрема и экваториальными отражениями, возникающими из-за длины цепи, расстояния между листами и размера протофиламента. Идеализированная диафракционная схема перекрестной бета-дифракции показала, что меридиановые и экваториальные отражения соответствуют повторяющимся расстояниям вдоль осей волокна.

Хорошо центрированная дифракционная картина была симметричной, при этом экваториальные и меридиановые пики перекрывались по положению. Пики дифракции автоматически обнаруживались и регистрировались с помощью анализа пиков. Обнаруженные дифракционные пики использовались для определения правдоподобных размеров элементарных ячеек.

Структурная модель была подготовлена с использованием идентифицированной единичной ячейки и визуализирована перед дифракционным моделированием. Смоделированные дифракционные данные, полученные из предлагаемой структурной модели, показали разумное соответствие с экспериментальной дифракционной картиной как по положениям отражения, так и по относительной интенсивности. Наложение смоделированных и экспериментальных дифракционных паттернов дополнительно продемонстрировало выравнивание соответствующих отражений.

Правильное выравнивание образцов критически важно, так как определяет качество дифракционных данных и получаемую из них информацию. Эта работа позволяет моделировать структуру с атомарным разрешением и интегрировать с другими структурными методами, такими как AFM, для создания детальных молекулярных структур.