In vitro Восстановление бактериальной убиквитинации и элиминация через VCP/p97

Наша работа раскрывает, как VCP или p97 действует как цитозольный защитник от множества различных патогенов. Это раскрывает потенциал VCP или p97 для терапевтических применений и биоинженерных стратегий. Помимо рутинной биохимии, сверхразрешающая микроскопия, крио-ЭМ, крио-ЭТ используются для выяснения, как эти эффекторы хозяина организуются на патогене для их уничтожения.

Для начала, выращивайте пневмонию стрептококка шести сортов серотипа два за ночь при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в дрожжевой среде Todd Hewitt. Инокуляйте одну часть ночной культуры в 10 частей свежей дрожжевой среды Todd Hewitt и инкубируем при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа до достижения оптической плотности на 600 нанометрах до 0,4. Затем смешайте 900 микролитров культуры пневмонии стрептококка с 600 микролитрами 50% глицерила и храните запас глицерина при минус 80 градусах Цельсия.

Затем разморозьте свежий запас пневмонии стрептококка с минус 80 градусов Цельсия и полностью инокулируйте его в пять миллилитров дрожжевого материала Todd Hewitt. Возьмите примерно 10 на мощность семи клеток пневмонии стрептококка. Для тщательной промывки бактерии снова суспензируют в буфере реакции и центрифугируют при температуре 21 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре.

Заново суспензуйте гранулу с помощью лизата из 549 клеток млекопитающих. Затем добавьте очищенный убиквитин и один миллимолярный аденозинтрифосфат и инкубировать смесь в течение одного-двух часов при 27 градусах Цельсия. Затем промывайте бактерии один раз реакционным буфером с одним молярным мочевиной, затем двумя дополнительными промывами только реакционным буфером.

Зафиксируйте бактерии с помощью 1% параформальдегида. После фиксации инкубируют клетки PBS, содержащим один миллиграмм глицина на миллилитр, в течение 15 минут. Потом дважды мойте с помощью PBS.

Приготовьте реакционную смесь, смешав убиквитин с другими необходимыми компонентами в реакционном буфере. Отрегулируйте общий объём реакционной смеси до 100–150 микролитров. Повторно суспензировать бактерии в реакционной смеси фермента убиквитин и инкубировать суспензию в течение двух часов при 27 градусах Цельсия.

После трёхкратной промывки бактерий реакционным буфером, содержащим мочевину, фиксируйте их с помощью 1% параформальдегида. После фиксации инкубируют клетки PBS, содержащим один миллиграмм глицина на миллилитр, в течение 15 минут. Затем инкубировать образец в 3% BSA в течение часа при 27 градусах Цельсия и дважды промой с помощью PBS.

Повторно суспендировать убиквитинированные бактерии в первичном растворе антител, приготовленном в более высоких концентрациях, чем обычно применяемые в иммунофлуоресцентных анализах. Затем инкубировать один час при 27 градусах Цельсия. После дважды промывания бактерий PBS снова суспензируют их в соответствующих вторичных антителах, сопряжённых с Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 555.

Теперь отлийте примерно 10–20 микролитров маркированного бактериального образца на стеклянное стекло и смешайте с 5–10 микролитрами монтажной среды с DAPI или без него. Накройте образец крышкой и используйте папирочную бумагу, чтобы промокнуть лишнюю жидкость. Объедините шесть микромолярных VCP p97 с одним микромоляром NPLOC4 и одним микромоляром UFD-1.

Отрегулировать объём реакционной смеси примерно до 90 микролитров с помощью реакционного буфера и инкубировать на льду в течение двух часов. Далее добавьте один-два миллимолярных аденозинтрифосфата в реакционную смесь, содержащую p97 UFD-1, NPLOC4. Затем комбинируйте это с 10 к мощности семи убиквитинированных клеток пневмонии стрептококка и инкубируем в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.

Сразу после обработки возьмите из реакционной смеси 10 микролитров аликвот и проведите серийное разбавление. Нанесите от 10 до 20 микролитров каждого разбавления на пластины инфузии мозга, сердца. Оцените формирование колоний между точками времени с нулём и двумя часами.

Рассчитайте процент жизнеспособности бактерий, деля двухчасовое количество КМО на нулевое количество КМО и умножение на 100. Значительная убиквитинация Streptococcus pneumoniae наблюдалась при лечении либо лизатом клеток млекопитающих, либо восстановленной системой ферментов E-1, E-2, E-3. Сигнал убиквитинации отсутствовал в контроле и заметно ослабел при воздействии OTUB1 убиквитинированного стрептококка пневмонии, что подтвердило модификацию полиубиквитина, связанную с K48.

Анализ линейного профиля показал полное пересечение убиквитина и бактериальных сигналов, подтверждая их пространственную колокацию. Трёхмерная реконструкция подтвердила пространственное перекрытие сигналов убиквитина и стрептококка пневмонии. Дикий тип p97 в сочетании со своими кофакторами UFD1 и NPLOC4 снижал жизнеспособность бактерий до 10–20% через два часа, независимо от того, проводилась ли убиквитинация с помощью клеточного лисата или очищенной ферментной системы.

Снижение жизнеспособности бактерий при исключении убиквитинации, при термоинактивации p97 или использовании каталитически неактивного p97, мутанта E57 8Q, что подтверждает, что как убиквитинация, так и активный p97 необходимы для уничтожения бактерий. Наше исследование открывает двери о том, как убиквитиновые лигазы хозяина E3 модифицируют различные патогены и изучают механизмы эффектора для устранения инфекционных угроз. Далее мы стремимся изучить, как регулируется p97 или VCP, и дальше доработать его для повышения антибактериальной активности.