Процедура отбора проб на основе фенол-красной нити для нецеленаправленной липидомики слезной жидкости при обнаружении биомаркеров

Мы разработали более стандартизированный, простой в использовании метод на основе фенолов-красной нити, чтобы помочь достичь воспроизводимых липидомных профилей слёз для будущих открытий биомаркеров слёз. Текущая проблема заключается в том, что полоски Ширмера раздражают, а капилляры демонстрируют изменчивость операторов в сборе слёз. Это затрудняет отчётность экспериментов и сравнения между исследованиями.

Для начала наденьте перчатки и тщательно продезинфекцируйте рабочее место, чтобы предотвратить загрязнение образца. Держите фетно-красную нить за конец напротив согнутого крючка, стараясь не касаться области согнутого крючка. Попросите испытуемого направить взгляд в сторону верхнего носа.

Затем аккуратно опустите нижнее веко испытуемого и введите феноло-красную нить с помощью согнутого крючка, установленного в нижней височной пальпебральной конъюнктиве возле внешнего угла глаза. Теперь попросите субъекта аккуратно закрыть глаза и слегка наклонить голову вперёд, чтобы фенол-красная нить не касалась кожи на лице. Снова опустите нижнее веко испытуемого и аккуратно уберите фенол-красную нить, избегая контакта с выбранной областью.

Запишите длину выбранной красной области. И используя стерильные щипцы, перенесите ПРТ в новую пробирку. Теперь правильно маркируйте и закрывайте пробирку.

Если длина образца меньше 50 миллиметров, попросите испытуемого отдохнуть одну-три минуты, а затем повторите сбор слезной жидкости с помощью того же глаза. Каждый новый отбор ПРТ поместить в отдельную пробирку. Используя метанол и чистые бумажные салфетки, тщательно очистите перчатки и щипцы, чтобы удалить остатки слёз или загрязнения.

Затем дайте им полностью высохнуть на воздухе. Запечатайте все пробирки парапленкой и сразу храните их при минус 20 градусах Цельсия для временного хранения или при минус 80 градусах Цельсия для длительного хранения. Предварительно промыйте микроножницы и щипцы метанолом, прежде чем обрабатывать нити фенол-красного цвета.

Отрежьте согнутый конец крюка примерно на первые три миллиметра от каждой фенол-красной нити. Разрежьте пробную область до фронта фенол-красного красителя на два миллиметровых кусочка и соберите эти сегменты с помощью чистой 1,5-миллилитровой органической микроцентрифуга, устойчивой к растворителям. Уберите согнутый конец крюка и нежелательную область PRT.

Поместите образцы на лёд, чтобы поддерживать низкую температуру перед извлечением. Теперь добавьте 232 микролитра ледяного метанола масс-спектрометрической масс-спектрометрии в каждый образец и проведите вихрь на 15 секунд, чтобы тщательно перемешать. Соникуйте образцы в предварительно охлаждённом ультразвуковом очистителе в течение 15 минут.

Затем добавьте 774 микролитра метил-бутилэфира ВЭЖХ и 194 микролитра деионизированной воды в каждый образец. Снова подвергайте Vortex на 15 секунд, чтобы тщательно перемешать растворители. Снова соникуйте образцы в предварительно охлажденном ультразвуковом очищающем средстве ещё 15 минут.

После соникации инкубировать образцы в термомиксере, установленном на 4 градуса Цельсия, с встряхиванием при 1200 оборотах в минуту в течение восьми часов. Затем оставьте смесь при комнатной температуре без помех 10 минут. Центрифугуйте смеси при 10 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

После центрифугирования убедитесь, что смеси видно разделены на две отдельные жидкие фазы. Аккуратно соберите 700 микролитров верхней органической фазы, содержащей липиды, и переместите их в заранее охлаждённую новую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра. Отбросьте нижнюю водную фазу, которая содержит остаточный метил-трет-бутилэфир и метанол как опасные химические отходы.

Сушите липидные экстракты с помощью охлаждённого концентратора SpeedVac, установленного при 4 градусах Цельсия, в течение четырёх часов. Затем храните высушенные липидные экстракты при минус 20 градусах Цельсия для краткосрочного хранения или при минус 80 градусах Цельсия для длительного хранения. Приготовьте смесь растворителя метанол-хлороформ, смешав метанол с хлороформом в соотношении объёма один к одному.

Восстанавлите высушенные липидные экстракты с помощью 50 микролитров ледяной смеси растворителя метанола и хлороформа. Соникизуйте восстановленный раствор в предварительно охлажденном ультразвуковом очищающем средстве в течение 15 минут. Теперь центрифугуйте восстановленные липидные экстракты при 14 000 G и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Аккуратно переведите 40 микролитров полученного супернатанта в автоматический стеклянный флакон с стеклянной вставкой. Плотно закройте флакон крышкой с открытой верхней крышкой с неразрезной перегородкой, чтобы подготовить его к анализу жидкой хроматографии с помощью тандемной масс-спектрометрии. С использованием строгих критериев было выявлено 773, 890 и 1025 уникальных видов липидов в группах соответственно для реплицирования одного, второго и трех групп образцов.

Положительный ионный режим выявил 1 302 вида липидов с идентификацией 26% степени A, 13,2% grade B и 60,8% степени C. Отрицательный ионный режим выявил 257 видов липидов с примерно 8,2% степени A, 22,9% степени B и 68,9% степени C. Несмотря на вариации, связанные с хранением, 394 уникальных вида липидов были последовательно выявлены во всех трёх наборах выборок.

Межсубъектовый коэффициент вариации за три визита составлял 21,5% в положительном режиме и 31,3% в отрицательном. Этот протокол устраняет отсутствие стандартизированного рабочего процесса для воспроизводимого липидомического анализа слёзой и может повысить сопоставимость между исследованиями. Наш метод на основе PRT минимизирует раздражение, позволяет быстро собирать слёзы и снижает изменчивость оператора.

Наши будущие исследования будут валидировать биомаркеры слезной липидомии в больших когортах и интегрировать мультиомику для персонализированной диагностики.