Визуализация пермеабилизации лизосомальной мембраны при некроптозе с помощью живых клеток
14 ноября 2025 г.
Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток для мониторинга пермеабилизации лизосомальной мембраны во время некроптоза с использованием флуоресцентных зондов, которые обнаруживают изменения целостности лизосомальной мембраны и закисление.
Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток для мониторинга проницаемости лизосомной мембраны во время некроптоза с использованием флуоресцентных зондов, которые обнаруживают изменения целостности лизосомной мембраны и их закисление. Задача в этой области — охарактеризовать динамику повреждённых органелл в процессе гибели клеток и точно определить, как это повреждение должно способствовать или способствовать гибели клеток. Для начала наложите 5 000 клеток в два миллилитра антибиотиками DMEM-среды в стерильную чашу с стеклянным дном.
Поставьте блюдо в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и инкубируйте клетки на ночь. Добавьте 20 микролитров зелёных бусинок декстрана до 25 микрограмм на миллилитр в свежую смесь DMEM, добавленную антибиотиками, чтобы разбавить. Удалите старую смесь из блюда и замените его двумя миллилитрами дополнительного DMEM-медиа с говядиной.
Поместите блюдо в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа, и инкубируйте 24 часа, чтобы бусины могли проникнуть в лизосомы. Теперь добавьте два микролитра одного миллимолярного раствора LysoTracker к двум миллилитрам свежего DMEM-среды. Замените старый материал на этот раствор для окрашивания.
Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение двух часов. Включите компоненты конфокальной системы, включив персональный компьютер, микроскоп, питание сканера, мощность лазера, лазерное излучение и питание Leica. Включите элементы управления окружающей средой, включая регулятор температуры под названием Куб и контроллер газового миксера на углекислом газе под названием Brick.
Откройте подачу углекислого газа и кислорода. Установите регулятор температуры на 37 градусов Цельсия. Установите контроллер газа и влажности на 5% углекислого газа и 95% влажности.
Соберите камеру визуализации. После окрашивания промыйте клетки три раза двумя миллилитрами PBS, затем добавьте два миллилитра свежего дополнительного DMEM-медиа. Перед съёмкой нанесите иммерсионное масло на объективную линзу.
Установите антенну на стадии микроскопа. Отрегулировать интенсивность лазера до 3%, но не более 5%, затем отрегулировать усиление детектора в программном обеспечении микроскопа для оптимизации сигнала. Минимизируйте фон, регулируя полосу контраста.
Получите исходные изображения необработанных клеток, которые служат контрольным условием. Верните пластину в ламинарный капюшок и добавьте один миллилитровый антибиотик DMEM с индукторами клеточной гибели. В программном обеспечении установите режим на XYT, форматирование на 512 на 512, скорость на 400, увеличение до трёх, среднее по линии на один, накопление строк на три, накопление кадров на один, интервал времени до трёх минут, длительность до восьми часов и включите автофокус.
Нажмите «Старт», чтобы начать таймлапс-приобретение. Первичная визуализация подтвердила наличие стабильной пункты LysoTracker и флуоресцеин-меченого декстран, что указывает на целосные лизосомы до лечения. Через четыре часа после обработки TSZ флуоресценция LyoTracker заметно снизилась, а декстран начал проявлять диффузное цитозольное распределение, что указывает на начальную проницаемость лизосомной мембраны.
К восьми часам после обработки сигнал LysoTracker почти полностью исчез, в то время как многие клетки сохраняли зелёный декстран-пункт с диффузным зелёным цитозольным сигналом. Мы демонстрируем, что пермеаболизация лизосомной мембраны может быть непосредственно визуализирована в живой клетке, проходящей некроптотическую индукцию. Этот протокол демонстрирует, что сочетание LysoTracker и декстранных шариков позволяет одновременно отслеживать pH лизосомы и высвобождение груза в реальном времени.
Важным для развития этого протокола изображения на живых клетках является его способность отслеживать небольшое изменение pH и проницаемость лизосомной мембраны в реальном времени, фиксируя динамические события, которые упускаются при анализе конечных точек, таких как проточная цитометрия и монослойное окрашивание.
Обзор
В данном протоколе описан метод визуализации живых клеток для мониторинга проницаемости лизосомальных мембран при некроптозе. В методе используются флуоресцентные зонды для обнаружения изменений целостности и закисления лизосомальных мембран.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Нейробиология
- Визуализация живых клеток
Теоретическая часть
- Характеристика повреждения органелл в процессе гибели клеток имеет решающее значение.
- Понимание того, как повреждение лизосом способствует гибели клеток, является сложной задачей.
- Визуализация живых клеток позволяет наблюдать за клеточными процессами в режиме реального времени.
- Флуоресцентные зонды могут указывать на целостность лизосом и изменения pH.
Цель исследования
- Разработать метод мониторинга проницаемости лизосомальных мембран.
- Визуализировать изменения в режиме реального времени в процессе некроптоза.
- Углубить понимание динамики лизосом при гибели клеток.
Используемые методы
- Посев клеток и инкубация в среде DMEM с добавлением антибиотиков.
- Окрашивание красителем LysoTracker и декстрановыми микросферами для визуализации лизосом.
- Конфокальная микроскопия для получения изображений клеточных изменений с течением времени.
- Съемка в режиме таймлапс для мониторинга целостности лизосом и pH.
Основные результаты
- Первичное изображение показало стабильное состояние лизосом до индукции некроптоза.
- После обработки наблюдалась пермеабилизация мембран лизосом.
- Мониторинг в реальном времени выявил изменения pH лизосом и высвобождение их содержимого.
- Данный метод позволяет фиксировать динамические клеточные события, которые упускаются при конечном анализе.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно визуализировать изменения лизосомальной мембраны при некроптозе.
- Сочетание LysoTracker и декстрановых микросфер обеспечивает комплексное понимание процессов.
- Этот подход способствует развитию исследований механизмов гибели клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Визуализация проницаемости лизосомных мембран (LMP) в живых клетках в режиме реального времени во время некроптоза восполняет критический пробел в понимании механизмов регулируемой гибели клеток, что имеет важное значение для валидации мишеней и снижения механистических рисков. Данный подход позволяет точно картировать временную динамику дисфункции органелл, повышая прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и трансляционных исследований. Интеграция динамического мониторинга LMP помогает в принятии решений по портфелю препаратов за счет уточнения путей гибели клеток и потенциальных точек терапевтического воздействия.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую визуализировать лизосомальную дисфункцию как раннее событие некроптоза.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между LMP и последующими результатами гибели клеток.
- Повышает прогностическую уверенность в связывании с мишенью и изучении сигнальных путей.
- Облегчает отбор мишеней на основе функциональных показателей в режиме реального времени.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные системы с живыми клетками для количественной оценки целостности лизосом.
- Обеспечивает воспроизводимые масштабируемые методы визуализации для скрининга соединений.
- Обеспечивает стандартизированные мультиплексные показатели изменений pH и высвобождения содержимого.
- Позволяет проводить надежную оценку потенциальных модуляторов, влияющих на пути некроптоза.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет механистические маркеры гибели клеток с моделями, имеющими значение для заболевания, где это применимо.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации механизмов гибели клеток.
- Поддерживает продвижение проекта с учетом рисков путем уточнения окон терапевтического вмешательства и динамики биомаркеров.
- Обеспечивает прогностическое снижение рисков для стратегий трансляционных биомаркеров.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол визуализации живых клеток интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая возможность динамической оценки целостности органелл и прогрессирования гибели клеток.
- Открывающая биология: поддерживает проверку гипотез о последовательности и причинно-следственной связи событий некроптоза.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты визуализации для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет измерения pH лизосом и выхода содержимого в режиме реального времени для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает механизмы процесса с валидацией на доклинических моделях при установлении значимости для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу визуализации для различных исследований гибели клеток и целостности органелл.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неопределенность в понимании механизмов гибели клеток.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы визуализации живых клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления биологических рисков.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней и путей с учетом рисков на основе динамических функциональных данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с живыми клетками и эксплуатацией конфокального микроскопа.
- Необходим доступ к современному оборудованию для визуализации и системам контроля окружающей среды.
- Требуется межгрупповая стандартизация параметров визуализации и анализа данных.
- Может потребоваться адаптация для различных типов клеток или моделей заболеваний.
- Ограничено необходимостью в инфраструктуре для визуализации в режиме реального времени и совместимостью флуоресцентных зондов.
