Визуализация пермеабилизации лизосомальной мембраны при некроптозе с помощью живых клеток

Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток для мониторинга проницаемости лизосомной мембраны во время некроптоза с использованием флуоресцентных зондов, которые обнаруживают изменения целостности лизосомной мембраны и их закисление. Задача в этой области — охарактеризовать динамику повреждённых органелл в процессе гибели клеток и точно определить, как это повреждение должно способствовать или способствовать гибели клеток. Для начала наложите 5 000 клеток в два миллилитра антибиотиками DMEM-среды в стерильную чашу с стеклянным дном.

Поставьте блюдо в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и инкубируйте клетки на ночь. Добавьте 20 микролитров зелёных бусинок декстрана до 25 микрограмм на миллилитр в свежую смесь DMEM, добавленную антибиотиками, чтобы разбавить. Удалите старую смесь из блюда и замените его двумя миллилитрами дополнительного DMEM-медиа с говядиной.

Поместите блюдо в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа, и инкубируйте 24 часа, чтобы бусины могли проникнуть в лизосомы. Теперь добавьте два микролитра одного миллимолярного раствора LysoTracker к двум миллилитрам свежего DMEM-среды. Замените старый материал на этот раствор для окрашивания.

Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение двух часов. Включите компоненты конфокальной системы, включив персональный компьютер, микроскоп, питание сканера, мощность лазера, лазерное излучение и питание Leica. Включите элементы управления окружающей средой, включая регулятор температуры под названием Куб и контроллер газового миксера на углекислом газе под названием Brick.

Откройте подачу углекислого газа и кислорода. Установите регулятор температуры на 37 градусов Цельсия. Установите контроллер газа и влажности на 5% углекислого газа и 95% влажности.

Соберите камеру визуализации. После окрашивания промыйте клетки три раза двумя миллилитрами PBS, затем добавьте два миллилитра свежего дополнительного DMEM-медиа. Перед съёмкой нанесите иммерсионное масло на объективную линзу.

Установите антенну на стадии микроскопа. Отрегулировать интенсивность лазера до 3%, но не более 5%, затем отрегулировать усиление детектора в программном обеспечении микроскопа для оптимизации сигнала. Минимизируйте фон, регулируя полосу контраста.

Получите исходные изображения необработанных клеток, которые служат контрольным условием. Верните пластину в ламинарный капюшок и добавьте один миллилитровый антибиотик DMEM с индукторами клеточной гибели. В программном обеспечении установите режим на XYT, форматирование на 512 на 512, скорость на 400, увеличение до трёх, среднее по линии на один, накопление строк на три, накопление кадров на один, интервал времени до трёх минут, длительность до восьми часов и включите автофокус.

Нажмите «Старт», чтобы начать таймлапс-приобретение. Первичная визуализация подтвердила наличие стабильной пункты LysoTracker и флуоресцеин-меченого декстран, что указывает на целосные лизосомы до лечения. Через четыре часа после обработки TSZ флуоресценция LyoTracker заметно снизилась, а декстран начал проявлять диффузное цитозольное распределение, что указывает на начальную проницаемость лизосомной мембраны.

К восьми часам после обработки сигнал LysoTracker почти полностью исчез, в то время как многие клетки сохраняли зелёный декстран-пункт с диффузным зелёным цитозольным сигналом. Мы демонстрируем, что пермеаболизация лизосомной мембраны может быть непосредственно визуализирована в живой клетке, проходящей некроптотическую индукцию. Этот протокол демонстрирует, что сочетание LysoTracker и декстранных шариков позволяет одновременно отслеживать pH лизосомы и высвобождение груза в реальном времени.

Важным для развития этого протокола изображения на живых клетках является его способность отслеживать небольшое изменение pH и проницаемость лизосомной мембраны в реальном времени, фиксируя динамические события, которые упускаются при анализе конечных точек, таких как проточная цитометрия и монослойное окрашивание.