Очистка экстравиллированных трофобластов HLA-G⁺ из тканей плаценты человека для фенотипирования и функционального анализа

Этот протокол предназначен для очистки первичных человеческих трофобластов из тканей плаценты человека с целью изучения их функциональных свойств и иммунологических свойств при здоровой беременности и патологических условиях. Таким образом, этот протокол предоставляет воспроизводимую платформу для преодоления некоторых прежних ограничений при работе с первичными человеческими экстравиллными трофобластами, а именно их жизнеспособности. Поэтому этот протокол действительно оптимизирован для повышения их жизнеспособности и чистоты.

Для начала возьмите образец плаценты человека. Разместите плаценту так, чтобы эмбриональная сторона была направлена вверх, чтобы место вставки пуповины было видно. Вручную отлепите амнион от латеральной мембраны к месту установки пуповины и удалите его.

Затем с помощью ножниц разрезать и сбросить амнион. Разрежьте хориодецидуальную мембрану на полоски длиной два дюйма, начиная от основания плаценты вверх, при этом каждая полоска прикреплена к плаценте. Полоску хориодецидуальной мембраны наместите на два пальца, чтобы децидуальная сторона была обращена вверх.

С помощью пары стерильных изогнутых щипцов аккуратно соскребли материнскую теменную мышцу с хориона. Соберите париеталный децидуальный мышец в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 20 миллилитров PBS для выделения лимфоцитов. Затем соберите хорионическую мембрану в отдельную 50-миллилитровую коническую трубку с 20 миллилитрами промывки А. С помощью ножниц разрежьте хорионическую мембрану внутри 50-миллилитровой трубки на части меньше двух квадратных миллиметров.

Сбросьте среду для стирки A из тюбика. Промывайте салфетку многократно с помощью PBS, пока супернатант не станет прозрачным. При рассечении плаценты разместите плаценту с материнской стороны, направленной вверх, и удаляйте тромбы.

С помощью стерильных ножниц отрежьте кусочки базальной пластины плаценты, избегая некротических, кальцифицированных или ишемических участков. Положите кусок decidua basalis на пальцы ворсинками вверх. Затем с помощью ножниц аккуратно удаляем ворсинки, получая мембрану диаметром 2–3 миллиметра, при этом остаётся только тонкий слой ворсинок.

Соберите ткань decidua basalis в коническую трубку объёмом 50 миллилитров, содержащую 20 миллилитров PBS. Затем нарежьте ткань на части меньше двух квадратных миллиметров. Далее выбросьте PBS из трубки.

Многократно промывайте децидуа базалис с помощью PBS, пока супернатант не станет чистым без видимой крови. Затем разделите 15 миллилитров тканевой суспензии на две конические трубки по 50 миллилитров. Заполните все трубки PBS.

Центрифугуйте трубки при 200G на одну минуту и вылейте супернатант. Добавьте 150 миллилитров тёплого ферментного коктейля для переваривания тканей в стеклянную бутылку на 300 миллилитров. Добавьте в бутылку 30 миллилитров хорионной мембраны.

Добавьте 20-миллилитровый тёплый коктейль DMEM/F-20 и 80 миллилитров тёплых ферментов переваривания тканей в две отдельные стеклянные бутылки по 300 миллилитров. Затем добавьте в каждую бутылку 7,5 миллилитров decidua basalis. Инкубировать бутылки в водяной бане.

Встряхивайте все бутылки каждые три-четыре минуты в течение 15-минутной инкубации. После пищеварения фильтруйте ткань через металлические сита с сеткой размером 40. Затем добавьте стирочный материал B, чтобы промыть салфетки и растворить желатиновый материал.

Переложите непереваренную ткань обратно в стеклянные бутылки и повторите пищеварение. Затем фильтруйте суспензии ячейки через 100-микрометровый фильтр в маркированные 50-миллилитровые конические трубки. Разделяйте клетки первого и второго пищеварения.

Затем центрифугуйте ячейку при 650G в течение восьми минут. Отбросьте супернатант. Объедините гранулы одного типа ткани и пищеварения в одну трубку.

Затем компенсируйте объём с помощью стиральной жидкости B до 25 миллилитров. Добавьте 12 миллилитров фиколла в четыре конические трубки по 50 миллилитров, маркированные типом ткани и номером пищеварения. Аккуратно нанесите клеточную суспензию на фиколл.

Затем центрифугуйте при 800G в течение 20 минут при комнатной температуре без разрыва. Аккуратно аспирируйте клеточный слой на границе с фиколловой средой и перенесите его в чисто маркированные трубки. Затем наполните пробирки средой B, центрифугуйте при 650G в течение восьми минут и снова подвежайте гранулы.

Поместить ресуспендированные гранулы в стерильные флуоресцентно-активированные трубки сортировки клеток, маркированные типом ткани и номером пищеварения. Добавьте антитела против CD45 BV785, анти-HLA GAPC и анти-EGFR1 BV711. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре в темноте.

После промывки и повторного подвешивания клеток в промывной среде B немедленно пропустите их через сито для ячейок объемом 40 микрометров. Сортировать CD45 отрицательный HLAG положительный экстравиллированный трофобласт в пробирки с одним миллилитровым EVT-культурным носителем A. Анализ потоковой цитометрии маркеров линии показал жизнеспособную первичную экстравиллированную трофобластную культуру до четвёртого дня. Репрезентативные световые микроскопические изображения первичного хорионического и децидуального базалиса положительных экстравиллированных трофобластов HLAG были получены после 24 часов, 48 часов и 72 часов культуры.

Экстравилльные трофобласты экспрессировали полиморфный HLAC и иммуносупрессивные коингибиторные молекулы. Экстравилльный трофобласт увеличил экспрессию HLAC, PD-L1, PD-L2 и HLA-E, но не увеличил экспрессию PVR и B7H3 при совместном культивировании с активированными лимфоцитами в течение 72 часов. После совместной культуры с активированными лимфоцитами не наблюдалось увеличения смерти от экстравиллированных трофобластов.

Таким образом, этот протокол позволяет учёным использовать первичные экстравиллированные трофобласты для широкого спектра анализов. Преимущество — высокая жизнеспособность, позволяющая проводить анализ с использованием клеточной культуры, холодной культуры, проточной цитометрии, протеомики, транскриптомики, используя эти действительно жизнеспособные экстравиллированные трофобласты с высоким доходом. Одним из самых важных аспектов нашего протокола является использование свежих плацентарных материалов.

Их нельзя хранить в холодильнике. Трофобласты любят умирать, поэтому, пожалуйста, получите ткани плаценты как можно скорее после родов, желательно в течение двух часов после родов, и всегда держите их при комнатной температуре. Это крайне важно для получения высокоэффективного экстравиллирующего трофобласта.

Поэтому некоторые из более дополнительных и продвинутых инновационных методов, для которых можно использовать эти первичные трофобласты, — это долгосрочная культура клеток. Их можно использовать для установления первичных четырёхдневных клеточных культур. Клетки будут жизнеспособны до 96 часов, что довольно долго, и позволяет проводить холодные культуры с иммунными клетками, такими как Т-клетки и NK-клетки.

Другая инновация — это возможность установления трофобластоподобных клеточных линий, используя методы, впервые описанные Аоки, и которые мы применяли на этих культурах для установления долгосрочных пролиферирующих типов клеток, которые можно использовать для редактирования генома и других более долгосрочных культурных анализов. Используя эти инновационные методы, включая долгосрочную клеточную культуру, я считаю, что это действительно поможет вам разработать долгосрочные механистические культуры, где можно применять редактирование генома, knock-out, knock-in гены, белки, чрезмерную экспрессию некоторых трофобластов, чтобы получить гораздо более механистические детали того, как трофобласты обеспечивают толерантность или обеспечивают иммунитет и большую цитотоксичность при взаимодействии с иммунными популяциями.