Автоматизированная подготовка образца для мультиплексированного анализа посттрансляционных модификаций гистонов с одной клетками (sc-hPTM2)
December 19th, 2025
Здесь мы представляем протокол автоматизации анализа посттрансляционной модификации гистонов в одной клеточке с использованием стратегии изотопного двухплексного маркировки и переваривания ArgC. Этот рабочий процесс позволяет количественное, воспроизводимое и высокочувствительное профилирование гетерогенности хроматина и эпигенетических ответов с одноклеточным разрешением.
Мы развиваем протеомику отдельных клеток с помощью автоматизированного мультиплексного метода для изучения глобальной гетерогенности хроматина для посттрансляционных модификаций. Сложность этого протокола — это подготовка протеома по шкале пикограммы, мультиплексная маркировка, а также разрешение сложных комбинаторно модифицированных гистонных пептидов. Для начала восстанавлите клетки гепатоцеллюлярной карциномы гепатита G2/C3A с конечной концентрацией от 200 до 500 клеток на микролитр в ледяной PBS.
Установите ширину импульса и напряжение каждого сопла, указанные производителем. Для максимальной эффективности звукоснимателя убедитесь, что смещение Z между двумя соплами отличается менее чем на 50 микрометров. Определите оптимальное положение контакта для каждого сопла и сравните показания высоты Z во вкладке настройки сопла.
Для схемы мультиплексирования кортежа загрузите один затвор на держатель затвора в капоте, а затем перенесите его на инструмент. Используя пипетку, налите 150 микролитров LCMS класса DMSO в новую ПЦР-трубку. Поставьте её во второе положение станции мойки, чтобы крышка трубки была обращена к дверцу прибора.
Начинайте запуск DMSO. Получите стабильный дроп один раз после аспирации DMSO. Обратите внимание на изменение прозрачности PDC.
Возможно, потребуется увеличить напряжение. Проверьте стабильность, проверив объём падения. Выполните настройку мастера головной камеры, чтобы выровнять камеру.
Отпустите DMSO и позвольте прибору автоматически промывать сопла и делать изображения на всех слайдах для контроля качества. Просмотрите эти изображения, чтобы проверить однородную каплю DMSO на каждом слайде и проверить, нет ли капель отсутствующих или нецелевых капель. После аспирации подвески ячейки откройте ячейку в одном модуле, выполните фоновый захват и затем запустите процедуру отображения для определения зоны выброса.
Проведите анализ, а затем заблокируйте частицы, чтобы выбрать ячейки по размеру и удлинению. Теперь приготовьте свежую мастер-смесь для пищеварения в воде класса LCMS. Дегаз раствора вакуумным насосом на льду в течение 10 минут.
После того как смесь для варения наливается на стеклы, дайте инструменту автоматически промить сопла и сфотографировать каждое слайдо. Просмотрите изображения, чтобы убедиться, что каждая капля равномерно получает смесь для переваривания. Инкубировать слайды при комнатной температуре на ночь для пищеварения.
После начала испарения и ночного переваривания осмотрите изображения. Если капли достаточно сухие, остановите бег. Если нет, нажмите «Продолжить» и сушите ещё пять минут.
Для маркировки сначала подготовьте стоковые растворы для мультиплексированной гистонной дервитизации. После дозирования позвольте инструменту автоматически промыть сопла и сфотографировать каждую затворку. Просмотрите изображения, чтобы убедиться в равномерном распределении и правильном расположении капель на всех слайдах.
После завершения инкубации введите гидроксиламиновый раствор для закалки. Чтобы взять образец, выберите забег в главной вкладке и начните его на вкладке. После завершения забора просмотрите изображения, чтобы проверить наличие ошибок.
После завершения пикапа снимите крышку с пластины звукоснимателя. Затем высушите образцы на низкой температуре в вакуумном концентраторе. Для сбора данных программируйте метод высокопроизводительной жидкостной хроматографии.
Настройте эксперимент MS 2 так, чтобы он содержал изоляционные окна с перезарядом массы 50, высокоэнергетическая диссоциация при столкновении 27% и цель автоматического контроля усиления 1000%. Накройте пластину резиновым уплотнительным ковриком и поместите её внутрь автопробоотборника. После получения исходных файлов кратко проверьте хроматограмму, а затем запустите исходные данные в версии EpiProfile 2.1. Просмотрите таблицу нормированных количества гистонов PTM и используйте её для дальнейших анализов.
Первые 20 пептидоформ гистонов H3 были количественно оценены, что показало их относительное содержание в контролируемых и бутиратных условиях. И ацетилирование H3 K9, и ацетилирование H3 K14 показали более высокую относительную объёмность при обработке бутиратом натрия. Хотя ацетилирование H3 K9, ацетилирование K14 выглядело ещё более обогащённым в обработанных клетках.
Общий уровень ацетилирования увеличился после обработки бутиратом натрия, при этом обработанные клетки показали более широкое распределение ошибок по сравнению с контрольными группами, отражающими более высокую гетерогенность, зафиксированную на уровне одной клетки. Количественная оценка одиночных и сопутствующих гистонных модификаций показала, что комбинаторные ацетилирующие состояния наиболее сильно подвергаются влиянию бутирата натрия. Более широкое распространение клеток, обработанных бутиратом натрия, свидетельствовало о повышении биологической гетерогенности отдельных клеток внутри сфероидов.
Этот протокол сокращает разрыв в эпигенетических исследованиях, позволяя учёным изучать состояния хроматина в растворе одной клетки. Этот рабочий процесс позволяет подготовить образцы с высокой производительностью, мультиплексировать образцы и использовать бесприкосвенную масс-спектрометрию для получения как чувствительных, так и количественных эпигенетических данных по отдельным клеткам. Будущие исследования будут изучать, как регуляция хроматина изменяет состояния заболеваний, такие как рак, метаболические заболевания и старение.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В данной статье представлен протокол для автоматизации анализа посттрансляционных модификаций гистонов в одиночных клетках с использованием стратегии изотопного двухкомпонентного маркирования. Рабочий процесс позволяет количественное и высокочувствительное профилирование гетерогенности хроматина с разрешением в одну клетку.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Протеомика одиночных клеток
- Посттрансляционные модификации гистонов
- Анализ хроматина
Бакграунд
- Анализ одиночных клеток важен для понимания клеточной гетерогенности.
- Посттрансляционные модификации играют ключевую роль в регулировании структуры и функции хроматина.
- Автоматизированные методы могут повысить воспроизводимость и чувствительность в протеомных исследованиях.
- К проблемам относятся обработка малых объемов образцов и сложных смесей пептидов.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол для анализа модификаций гистонов с разрешением в одну клетку.
- Повысить эффективность мультиплексного маркирования в протеомных рабочих процессах.
- Решить проблемы, связанные с низкой абунданностью пептидов гистонов.
Использованные методы
- Реконституция клеток Hep G2/C3A в PBS при указанной концентрации.
- Регулировка параметров сопла для оптимального забора образца.
- Внедрение изотопного двухкомпонентного маркирования для количественного анализа.
- Использование ArgC-дигестии для подготовки пептидов.
Основные результаты
- Успешная автоматизация анализа модификаций гистонов в одиночных клетках.
- Достигнута высокая чувствительность и воспроизводимость при профилировании.
- Эффективное разрешение сложных комбинаторных модифицированных пептидов гистонов.
- Взгляд на гетерогенность хроматина и эпигенетические реакции.
Выводы
- Разработанный протокол улучшает исследование динамики хроматина с разрешением в одну клетку.
- Автоматизация значительно повышает эффективность анализа модификаций гистонов.
- Этот метод может быть применен к различным биологическим вопросам, касающимся эпигенетики.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
