Автоматизированная подготовка образца для мультиплексированного анализа посттрансляционных модификаций гистонов с одной клетками (sc-hPTM2)

Мы развиваем протеомику отдельных клеток с помощью автоматизированного мультиплексного метода для изучения глобальной гетерогенности хроматина для посттрансляционных модификаций. Сложность этого протокола — это подготовка протеома по шкале пикограммы, мультиплексная маркировка, а также разрешение сложных комбинаторно модифицированных гистонных пептидов. Для начала восстанавлите клетки гепатоцеллюлярной карциномы гепатита G2/C3A с конечной концентрацией от 200 до 500 клеток на микролитр в ледяной PBS.

Установите ширину импульса и напряжение каждого сопла, указанные производителем. Для максимальной эффективности звукоснимателя убедитесь, что смещение Z между двумя соплами отличается менее чем на 50 микрометров. Определите оптимальное положение контакта для каждого сопла и сравните показания высоты Z во вкладке настройки сопла.

Для схемы мультиплексирования кортежа загрузите один затвор на держатель затвора в капоте, а затем перенесите его на инструмент. Используя пипетку, налите 150 микролитров LCMS класса DMSO в новую ПЦР-трубку. Поставьте её во второе положение станции мойки, чтобы крышка трубки была обращена к дверцу прибора.

Начинайте запуск DMSO. Получите стабильный дроп один раз после аспирации DMSO. Обратите внимание на изменение прозрачности PDC.

Возможно, потребуется увеличить напряжение. Проверьте стабильность, проверив объём падения. Выполните настройку мастера головной камеры, чтобы выровнять камеру.

Отпустите DMSO и позвольте прибору автоматически промывать сопла и делать изображения на всех слайдах для контроля качества. Просмотрите эти изображения, чтобы проверить однородную каплю DMSO на каждом слайде и проверить, нет ли капель отсутствующих или нецелевых капель. После аспирации подвески ячейки откройте ячейку в одном модуле, выполните фоновый захват и затем запустите процедуру отображения для определения зоны выброса.

Проведите анализ, а затем заблокируйте частицы, чтобы выбрать ячейки по размеру и удлинению. Теперь приготовьте свежую мастер-смесь для пищеварения в воде класса LCMS. Дегаз раствора вакуумным насосом на льду в течение 10 минут.

После того как смесь для варения наливается на стеклы, дайте инструменту автоматически промить сопла и сфотографировать каждое слайдо. Просмотрите изображения, чтобы убедиться, что каждая капля равномерно получает смесь для переваривания. Инкубировать слайды при комнатной температуре на ночь для пищеварения.

После начала испарения и ночного переваривания осмотрите изображения. Если капли достаточно сухие, остановите бег. Если нет, нажмите «Продолжить» и сушите ещё пять минут.

Для маркировки сначала подготовьте стоковые растворы для мультиплексированной гистонной дервитизации. После дозирования позвольте инструменту автоматически промыть сопла и сфотографировать каждую затворку. Просмотрите изображения, чтобы убедиться в равномерном распределении и правильном расположении капель на всех слайдах.

После завершения инкубации введите гидроксиламиновый раствор для закалки. Чтобы взять образец, выберите забег в главной вкладке и начните его на вкладке. После завершения забора просмотрите изображения, чтобы проверить наличие ошибок.

После завершения пикапа снимите крышку с пластины звукоснимателя. Затем высушите образцы на низкой температуре в вакуумном концентраторе. Для сбора данных программируйте метод высокопроизводительной жидкостной хроматографии.

Настройте эксперимент MS 2 так, чтобы он содержал изоляционные окна с перезарядом массы 50, высокоэнергетическая диссоциация при столкновении 27% и цель автоматического контроля усиления 1000%. Накройте пластину резиновым уплотнительным ковриком и поместите её внутрь автопробоотборника. После получения исходных файлов кратко проверьте хроматограмму, а затем запустите исходные данные в версии EpiProfile 2.1. Просмотрите таблицу нормированных количества гистонов PTM и используйте её для дальнейших анализов.

Первые 20 пептидоформ гистонов H3 были количественно оценены, что показало их относительное содержание в контролируемых и бутиратных условиях. И ацетилирование H3 K9, и ацетилирование H3 K14 показали более высокую относительную объёмность при обработке бутиратом натрия. Хотя ацетилирование H3 K9, ацетилирование K14 выглядело ещё более обогащённым в обработанных клетках.

Общий уровень ацетилирования увеличился после обработки бутиратом натрия, при этом обработанные клетки показали более широкое распределение ошибок по сравнению с контрольными группами, отражающими более высокую гетерогенность, зафиксированную на уровне одной клетки. Количественная оценка одиночных и сопутствующих гистонных модификаций показала, что комбинаторные ацетилирующие состояния наиболее сильно подвергаются влиянию бутирата натрия. Более широкое распространение клеток, обработанных бутиратом натрия, свидетельствовало о повышении биологической гетерогенности отдельных клеток внутри сфероидов.

Этот протокол сокращает разрыв в эпигенетических исследованиях, позволяя учёным изучать состояния хроматина в растворе одной клетки. Этот рабочий процесс позволяет подготовить образцы с высокой производительностью, мультиплексировать образцы и использовать бесприкосвенную масс-спектрометрию для получения как чувствительных, так и количественных эпигенетических данных по отдельным клеткам. Будущие исследования будут изучать, как регуляция хроматина изменяет состояния заболеваний, такие как рак, метаболические заболевания и старение.