Улучшенное пространственное картирование слоёв желудочных мышц мышей с использованием модифицированной техники Swiss Roll
25 ноября 2025 г.
Этот протокол описывает метод иммунокрашивки целого желудка, модифицированный из техники «Swiss roll», изначально разработанной для мышиного кишечника.
Наши исследования направлены на улучшение подготовки и анализа легкого желудка для проведения визуализации. Мы адаптировали технику Swiss Roll, изначально разработанную для мышиного кишечника, чтобы все основные области желудка, включая дно, тело и антрум, могли быть объединены в одну крио-секцию. Это позволяет визуализировать структуру желудка и клеточный состав рядом, сохраняя точную пространственную ориентацию и высокое качество изображения.
Желудок — это сложный орган с нежными тканями. Небольшие ошибки могут повредить клетки или исказить структуру, что делает высококачественную визуализацию и иммунное окрашивание непоследовательными. Наша техника Swiss roll решает эту задачу, сохраняя все области, включая двенадцатиперстную и пищевод в одном криоблоке, что делает эксперименты более надёжными и воспроизводимыми.
Для начала с помощью ножниц разрезайте вентральную брыжейку двенадцатиперстной кишки и желудка до штифта в корпусе. Используя трансферную пипетку, наполненную PBS, промывайте остатки пищи из просвета желудка. Аккуратно растяните открытый живот, чтобы получить ровное положение.
После короткой фиксации снова прижимите ткань плоско. С помощью ножниц обрезайте живот вдоль пунктирного контура, чтобы создать равномерную форму, подходящую для скручивания. Поместите обрезанную желудочную ткань на фильтрующую бумагу, увлажненную PBS.
Свернуть ткань в швейцарский рулон и закрепить её, вставив зубочистку в центр. После скрутки вставьте иглу 30-го калибра, чтобы закрепить её форму. Затем согните иглу под углом 90 градусов, чтобы стабилизировать свернутый желудок.
Зафиксируйте свернутую ткань в 4% параформальдегида при 4 градусах Цельсия в течение шести часов. Затем аккуратно снимите стабилизирующую иглу. Внедрить ткань в оптимальную температуру резки с помощью одноразовых форм для основания.
Затем заморозьте форму на сухом льду. После полной заморозки храните плесень при минус 80 градусах Цельсия. Новый метод позволил включить фундус, корпус, антрум, часть пищевода и двенадцатиперстную кишку в один срез гастрального швейцарского свалика у мышей.
Окрашивание гематоксилином и эозином в свалике желудочного швейцарского свалика выявило хорошо сохранившуюся архитектуру в дне, корпусе, муравиче, пищеводе и двенадцатиперстной клетке с чётко видимыми слоями слизистых, подслизистых и мышечных слоёв. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало экспрессию KIT и ANO1 в интерстициальных клетках Кахала и экспрессию бета-тубулина три в кишечных нейронах, что подтвердило сохранение клеток в желудочно-швейцарском рулоне. Экспрессия KIT также была обнаружена в клетах панет и кубка в слизистой желудке, тогда как ANO1 был высоко экспрессирован в фундических колоннарных эпителиальных клетках.
Экспрессия бета-тубулина три наблюдалась в клетках желудка, эндокринной и слизи, а также в кишечных нейронах. Окрашивание миозинов с тяжелой цепью 11 подтвердило наличие гладкомышечных клеток и миофибробласта в слизистой желудочной слизистой форме, тогда как окрашивание E-кадгерином показало эпителиальные клетки, а окрашивание KIT снова отмечало интерстициальные клетки Кахаля. Швейцарская дорожная техника может продвинуть исследования региональных изменений в ткани желудка.
В отличие от традиционных методов, которые встраивают регионы отдельно, швейцарская техника ролла обрабатывает все желудочные области при одинаковых условиях, экономя как время, так и реагенты. Это делает её практичной и масштабируемой платформой для всестороннего анализа желудочной ткани как в состоянии здоровья, так и при заболеваниях.
Обзор
В данном протоколе описан метод иммуноокрашивания всего желудка, модифицированный на основе техники «швейцарского рулета» (Swiss roll), которая изначально была разработана для кишечника мыши. Этот метод позволяет визуализировать структуру желудка и клеточный состав при сохранении пространственной ориентации и качества изображений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гастроэнтерология
- Гистология
Теоретические основы
- Желудок представляет собой сложный орган с хрупкими тканями.
- Традиционные методы часто приводят к несоответствиям при получении изображений и окрашивании.
- Метод «швейцарского рулета» (Swiss Roll Technique) позволяет совместно заливать в парафин несколько отделов желудка.
- Это повышает надежность и воспроизводимость экспериментов.
Цель исследования
- Улучшить подготовку и анализ тканей желудка для визуализации.
- Визуализировать все основные отделы желудка на одном криосрезе.
- Обеспечить точную пространственную ориентацию во время визуализации.
Используемые методы
- Адаптация метода «швейцарского рулета» для иммуноокрашивания всего желудка.
- Использование ножниц и пипеток для подготовки тканей.
- Заливка ткани в оптимальный состав для криофиксации (OCT).
- Окрашивание гематоксилином и эозином для оценки архитектуры ткани.
Основные результаты
- Хорошо сохраненная архитектура различных отделов желудка.
- Успешное иммунофлуоресцентное окрашивание специфических типов клеток.
- Продемонстрированная экспрессия ключевых белков в тканях желудка.
- Подтвержденное наличие гладкомышечных и эпителиальных клеток.
Выводы
- Метод «швейцарского рулета» (Swiss Roll Technique) расширяет возможности анализа тканей желудка.
- Он позволяет проводить одновременную обработку всех отделов желудка.
- Данный метод является практичным и масштабируемым для исследований в области здоровья и патологий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Последовательное пространственное картирование слоев желудочной мускулатуры имеет решающее значение для высокодостоверной валидации мишеней и снижения механистических рисков при поиске лекарственных средств для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. Модифицированный метод «швейцарского рулета» позволяет проводить воспроизводимый параллельный анализ всех основных отделов желудка мыши, что обеспечивает надежность сравнительных исследований и сводит к минимуму экспериментальную вариабельность. Этот масштабируемый подход повышает прогностическую точность на этапах раннего поиска и в рамках трансляционных исследований, сосредоточенных на биологии желудка.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить комплексный анализ клеточных маркеров в специфических областях глазного дна, тела и антрума желудка.
- Снижает биологические риски за счет сохранения нативной архитектуры тканей для точного анализа сигнальных путей.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью высококачественных данных иммунофлуоресценции и гистологического анализа.
- Повышает прогностическую достоверность при приоритизации желудочных мишеней в портфелях по поиску новых лекарственных средств.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых срезов тканей для последующей разработки анализа и рабочих процессов скрининга.
- Гарантирует количественную и качественную согласованность результатов иммуноокрашивания во всех отделах желудка.
- Позволяет масштабировать подготовку валидированных биологических образцов для высокопроизводительного анализа.
- Снижает расход реагентов и сокращает время проведения эксперимента за счет обработки всех отделов в идентичных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные пространственной омики и исследования биомаркеров с соответствующими областями желудка при заболеваниях для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает принятие обоснованных решений по дальнейшему развитию с учетом рисков за счет минимизации потери тканей и экспериментальной вариабельности.
- Обеспечивает возможность параллельного сравнения физиологических и патологических состояний в доклинических моделях.
- Усиливает механистическое снижение рисков при исследовании заболеваний желудка и разработке терапевтических средств.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в процесс поиска — от ранней валидации мишени до разработки анализа и доклинических исследований, предоставляя воспроизводимую платформу для пространственного и молекулярного анализа тканей желудка.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая анализ региональных маркеров в контексте нативной ткани.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые срезы, готовые к анализу, для количественного иммуноокрашивания и сравнительных исследований.
- Аналитика: обеспечивает высокоразрешающие мультиплексные результаты для надежного статистического сравнения отделов желудка.
- Трансляционные исследования: обеспечивает анатомическую и молекулярную непрерывность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Корпоративное использование: представляет собой масштабируемую стандартизированную платформу подготовки тканей для различных прикладных исследований желудка.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность в исследованиях мишеней желудка.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов подготовки тканей.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет минимизации экспериментальной вариабельности.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ исследований желудка.
Особенности реализации
- Для достижения оптимальных результатов требуются навыки работы с тканями, их фиксации и криорезекции.
- Необходим доступ к криостату, оборудованию для иммунофлуоресценции и гистологической визуализации.
- Требуется стандартизация протоколов ориентации тканей и окрашивания между различными исследовательскими группами.
- Метод адаптируем к различным моделям мышей и совместим с рабочими процессами пространственной омики.
- Результат зависит от осторожного обращения для сохранения хрупкой архитектуры желудка и минимизации потери тканей.
