Улучшение экранов CRISPR-Cas9 в CAR T-клетках: усовершенствованный метод подготовки библиотек

Наши исследования сосредоточены на использовании методов скрининга CRISPR для выявления целей и повышения эффективности терапий CAR T-клеток. Текущие задачи экспериментов включают достижение воспроизводимых лабораторных методов в подходах скрининга CRISPR. Для начала добавьте заранее определённое количество библиотеки вируса Lenta CRISPR в пластину на 24 лунки, содержащую Т-клетки.

Добавьте поли-мозг в конечной концентрации восемь микрограмм на миллилитр. Аккуратно перемешивайте, чтобы обеспечить равномерное распределение. Центрифугуйте клетки при 700 G в течение 90 минут при 32 градусах Цельсия для проведения спин-фекции.

После центрифугирования аккуратно вынимите пластину из центрифуги. Замените среду на свежую среду для роста Т-клеток. Через шесть часов добавьте вирусный вектор CAR lenta с множеством инфекции три.

Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в течение четырёх дней. После завершения инкубации соберите Т-клетки CAR. Постирайте один раз PBS.

Затем окрашивайте клетки с помощью акрадина-оранжевого пропидиевого йодида и пересчитывайте их в люминесцентном счётчике. Приготовьте четырёхмикромолярный раствор cas9 в электропорационном буфере. Подвесьте пять раз по 10 к питанию шести Т-элементов CAR в 50 микролитрах раствора cas9.

Затем пипетка 50 микролитров суспензии клетки в каждую яму, нескользкую кюветную полосу, не образуя пузырьков. Удалите видимые пузырьки, аккуратно проведя кончиком пипетки по краям колодца. Используйте программу расширения T-ячейки три для нуклеофектирования CAR T-клеток.

Поставьте кюветки в инкубатор при 37 градусах Цельсия на 40 минут. Ресуспензировать нуклеофектированные клетки в среде роста Т-клеток. Затем снова инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение трёх дней.

Считайте клетки с помощью окрашивания акрадина с йодидом пропидия в люминесцентном счётчике. После настройки плотности клеток до десяти до шести клеток на миллилитр добавьте пуромицин к конечной концентрации 2,5 микрограмма на миллилитр. После шести дней инкубации оцените процент CAR-положительных клеток с помощью проточной цитометрии.

Затем сортируйте популяции CAR T-клеток и храните сухие клеточные гранулы при минус 80 градусах Цельсия. Извлекать геномную ДНК из образцов с помощью метода экстракции клеточной и тканевой ДНК. Измерьте концентрацию геномной ДНК с помощью комплекта для количественной оценки двухцепочечной ДНК.

Далее переварить до пяти микрограммов геномной ДНК с 20 единицами выбранных рестрикционных ферментов в общим объёме 50 микролитров. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия в термоциклере. На следующий день приготовьте 10 миллилитров элюсионного буфера, содержащего 10 миллимоляртрис HCL и 50 миллилитров свежего 70%этанола.

Пипетте 100 микролитров переваренного продукта в трубку с вихрями. Пипетте, чтобы тщательно перемешать суспензию и инкубировать пять минут при комнатной температуре, а затем намагничить ещё пять минут. Находясь на магните, сбросьте супернатант и пипетка 200 микролитров раствора 70% этанола, не нарушая гранулу.

Через 30 секунд сбросьте супернатант и сделайте ещё две промывки спирта. После двух промываний дайте бусинам высохнуть две минуты, затем удалите их с магнита. Добавьте 40 микролитров элуцианского буфера и пипетку, чтобы снова подвесить шарики.

Намагничивайте подвеску на две минуты, затем переведите супернатант в новую трубку. Добавьте один буфер для связывания X Wash в трубку с одним миллиграммом магнитных шариков вихря стрептавидина. Пипет, чтобы подвесить бусины в буфере.

Затем поставьте подвеску на магнит на одну минуту, сбросьте супернатант и сделайте ещё две промывки. После третьей промывки переложите бусины в буфер с переплётом. Затем добавьте пять микролитров 10 микромолярных биотинилированных подтягивающих праймеров в очищенный продукт для пищеварения.

Инкубировать смесь в сухой ванне при 96 градусах Цельсия в течение пяти минут и сразу охладить на льду в течение пяти минут. Добавьте в реакцию один миллиграмм заранее промытых магнитных шариков со стрептавидином, чтобы объёмы реакции и стрептавидина были равны. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре, повторно суспендируя каждые четыре минуты.

Намагничивайте бусины на пять минут, затем трижды стирайте одним буфером для мытья. Наконец, суспензируйте шарики с связанной кассетой sgRNA в 50 микролитрах элюцианского буфера. Подготовьте и усилите библиотеку sgRNA и секвенируйте её.

После выбора антибиотиков CAR T-клетки, трансдуцированные с помощью библиотеки CRISPR, показали продолжение выживаемости и пролиферации у обоих доноров после лечения пуромицином. Нетрансдуцированные Т-клетки и CAR Т-клетки без трансдукции библиотеки CRISPR не показали сопоставимой пролиферации при отборе антибиотиков и выступали в качестве отрицательных контрольных факторов. Рестрикционное переваривание ферментов с помощью NDEL и PSPXI дало фрагментированную геномную ДНК при сохранении кассеты с одной направляющей РНК для обогащения.

Фрагменты, содержащие sgРНК, затем селективно амплировались. Корреляции Пирсона и Спирмана показали, что в образцах донорской геномной ДНК сохраняется одиночный показатель чтения РНК и сложность библиотеки по сравнению с библиотекой плазмид. Робастный анализ агрегации рангов выявил гены, которые были значительно обогащены или истощены после редактирования Cas9 у обоих доноров.

Анализ обогащения путей выявил основные термины генной онтологии, связанные с выявленными генетическими регуляторами. Наш протокол предлагает надёжную альтернативу существующим лабораторным методам с использованием методов скрининга CRISPR. Наши результаты помогут продвинуться в этой области, поддерживая разработку более воспроизводимых и надёжных протоколов скрининга CRISPR.

Наши результаты открыли путь к идентификации генов и могут быть модерированы для усиления фенотипа и функции Т-клеток CAR.