Мультиплексированный иммунофлуоресцентный анализ для пространственной оценки маркеров старения in vivo
24 июля 2026 г.
Мультиплексированная иммунофлуоресценция позволяет последовательно маркировать несколько маркеров антител в одном срезе ткани для пространственного анализа архитектуры тканей и популяций клеток. Здесь представлен рабочий процесс для мультиплексного обнаружения маркеров, связанных со старением, структурных и иммунных маркеров, включая ручную и автоматическую подготовку слайдов, итеративную визуализацию и анализ отдельных клеток с использованием программного обеспечения для цифровой патологии.
Пространственный анализ стареющих клеток важен для понимания их вклада в такие процессы, как старение, рак, иммунитет и нормальный гомеостаз тканей. Обнаружение стареющих клеток основывается на профилировании нескольких биомаркеров. Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация позволяет осуществлять высокопроизводительное профилирование этих препаратов в одном срезе ткани.
Для начала проверьте, что 5-микрометровые формалин-фиксированные, парафин-вложенные (FFPE) секции тканей размером 4 x 2 сантиметра в центре установлены на положительно заряженных микроскопических слайдах и хорошо видны в окне обзора держателя для затвора без покрытия. Выполните этапы подготовки образцов — вручную с помощью камеры для деклоакирования или автоматически с помощью автоматического окрасителя. Положите подготовленные слайды в держатель затвора без крышки.
Выровняйте верхний и правый края с металлическими упорами. Зафиксируйте затвор обеими руками одновременно, чтобы повернуть пластиковые кулачки в закрытое положение замка. Убедитесь, что затвор полностью ровно установлен и не качается внутри держателя.
Поставьте ClickWell, вставьте камеру поверх затвора и зажмите боковые планки обеими руками, чтобы ограничить давление и предотвратить поломки. Загрузите щелчок 2 миллилитрами монтажного материала, содержащего 50% глицерина в фосфатно-буферном физиологическом растворе через входной отверстие. Добавьте штрих-код на левую сторону затвора в любой из ориентаций, затем приступайте к съёмке.
Для выбора региона и анализа автофлуоресценции откройте программное обеспечение Mx Workflow версии 4204 для мультиплексного сбора изображений. Нажмите на «Инструменты», чтобы выбрать «Издатель протокола». В всплывающем окне Multiplex Protocol Publisher введите имя протокола.
Нажмите на Create Setup Round, затем добавьте Next Protocol Round, чтобы создать несколько раундов маркировки биомаркеров. Нажмите «Опубликовать», затем выберите «ОК» в всплывающем окне. Приобретите канал Cy3 для виртуальных изображений H&E.
Нажмите на слайд, затем создайте новую партию. После выбора имени протокола введите идентификатор слайда. Нажмите на «Добавить слайд», затем выберите «Создать пакет» для создания процесса мультиплексного эксперимента. Откройте программное обеспечение для получения Cell IVE.
Нажмите на «Загрузить», чтобы загрузить слайд в микроскоп. В выпадающем меню «Инструменты» нажмите на значок сетки, чтобы определить нужные регионы, и используйте инструмент «Переместить» для их перестановки. Далее используйте инструмент «Рисование», чтобы снять выделение ненужных полей, убедившись, что в каждом поле обзора есть как минимум два соседних поля для предотвращения проблем с сшиванием, и нажмите «Сохранить регионы».
В окне Mx Workflow нажмите на Viewer QC, чтобы открыть страницу просмотра Cell DIVE и визуализировать изображение ткани в 10-кратном увеличении. Нажмите на значок коррекции изображения, чтобы отрегулировать яркость, и выберите «Отправить качество», чтобы выбрать «Pass and Reload Slide» в всплывающем окне. После загрузки изображения нажмите Add ROI, чтобы нарисовать и настроить интересующие области.
Выберите нужные поля обзора и повторите добавление ROI. Далее нажмите «Отправить в лабораторию». Загрузите слайд для запуска 20-кратного автофлуоресцентного изображения.
В меню Imaging QC выберите галочку, соответствующую конкретному Slide ID, затем нажмите Viewer QC. Увеличите изображение, чтобы отсканировать неразмытые области или артефакты. Проверьте фоновые изображения каждого канала, которые будут вычитаны из итогового сигнала биомаркера. Нажмите Отправить QC, затем выберите Pass и Exit для создания фоновых изображений.
Перед последовательным окрашиванием биомаркеров центрифугайте антитела при 13 000 G в течение одной минуты при комнатной температуре, чтобы ограничить наличие артефактов. Приготовьте раствор антител с разбавлением 1 к 200 в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), содержащем 0,3% бычьего сывороточного альбумина, или BSA. Удалите монтажный материал, вытягивая пипетером из порта ClickWell.
И трижды промывайте 2 миллилитра PBS с 0,01% Tween 20 или PBST в течение 5 минут. Добавьте в порт 350 микролитров раствора антител, чтобы обеспечить полное покрытие образца в камере окрашивания. Инкубировать один час при комнатной температуре.
Далее выпустите раствор антител из порта ClickWell. И трижды стирать с 2 миллилитрами PBST в течение 5 минут. Добавьте 2 миллилитра монтажного материала.
Вставьте держатель ClickWell в микроскоп и загрузите слайд, чтобы начать 20-кратную биомаркерную визуализацию. Выполните контроль качества изображения с помощью редактора смешивания и опций коррекции изображения и отправьте оценку качества изображения. Вытащите монтажный материал пипеткой из порта ClickWell и трижды промывайте 2 миллилитрами PBST в течение 5 минут.
Перед использованием приготовьте раствор для инактивации красителя свеже. После удаления PBST добавьте 2 миллилитра раствора для инактивации красителя на каждое стекло. Инкубировать 15 минут в держателе для затвора.
Вытащите раствор для инактивации красителя пипеткой из порта ClickWell и промывайте 2 миллилитрами PBST в течение 5 минут. Добавьте 2 миллилитра монтажного материала и вставьте держатель ClickWell в микроскоп для запуска автоматической кругло-специфичной автофлуоресцентной визуализации 20x. Продвигайте рабочий процесс, проходя шаги контроля качества, указанные на экране после завершения.
Повторяйте последовательное окрашивание, инактивацию красителем и мультиплексную визуализацию для необходимого количества маркеров и продолжайте до завершения. Используйте программное обеспечение HALO для выбора различных каналов визуализации локализации маркеров в разных областях ядра ткани. Нажмите «Анализировать» и выберите «Полное изображение», чтобы проанализировать количественные метрики отдельных маркеров.
Нажмите на «Результаты», чтобы увидеть общее количество клеток в анализируемом ядре ткани и подмножество клеток, экспрессирующих специфические маркеры. По сравнению с автоматическим методом на основе стеклянного окрашивателя, ручной метод деблокировки в камере привёл к более высокой частоте тканевых артефактов, характерных именно отслоением тканей, а также потерями или смещением ядер. Количественная оценка, проведённая с помощью цифрового программного обеспечения для репрезентативной ткани поджелудочной железы, показала, что p16-положительные клетки связаны с более низким уровнем LB1 и наоборот, что демонстрирует профиль, соответствующий паттернам маркеров, связанных с старением.
Нормализованная тепловая карта с Z-баллом иллюстрирует распределение позитивного фенотипа p16 отрицательного ламин-B1 старения по различным тканям, выявляя высокие концентрации стареющих клеток в легких, надпочечниках и гипофизе, что соответствует повышенному p16 и снижению уровня LB1. В то же время аппендикс, лимфатический узел и селезёнка демонстрировали низкую старение, сохраняя высокий уровень LB1 и низкую экспрессию p16. Этот протокол позволяет исследовать комбинацию стареющих, структурных и иммунных биомаркеров внутри одного микроскопического слайда.
Комбинируя несколько маркеров в одном образце, можно провести пространственный анализ архитектуры тканей и распределения стареющих клеток. Будущие применения включают масштабное профилирование биомаркеров старения в различных типах тканей и интеграцию с пространственной омиксой для лучшего выявления клеточной гетерогенности.
Overview
This article presents a comprehensive protocol for multiplexed immunofluorescence (IF) staining, enabling the simultaneous detection of multiple antibody markers within a single tissue section. The method is particularly suited for profiling senescent cells across diverse human tissue types, allowing for detailed spatial and quantitative analysis that surpasses traditional IF techniques.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Immunofluorescence imaging
- Digital pathology
- Tissue microarray analysis
Background
- Traditional IF imaging is limited in the number of markers that can be assessed simultaneously.
- Senescence lacks a universal biomarker; signatures vary by cell type, trigger, and time since induction.
- Multiplexed IF allows for the detection of multiple markers in a single tissue section, improving cell type and structure profiling.
- Spatial relationships between cell types and tissue structures are critical for understanding senescence in situ.
Purpose of Study
- To provide a detailed protocol for multiplexed IF staining and imaging of human tissue samples.
- To enable unbiased detection and spatial analysis of senescent cells using combinatorial biomarker approaches.
- To demonstrate the utility of multiplexed imaging for comprehensive tissue profiling.
Methods Used
- Tissue microarrays from 34 human tissue types were utilized.
- 10-plex immunofluorescence staining targeting structural, immune, and senescence biomarkers.
- Sequential staining, imaging, and dye inactivation cycles to build multiplex datasets.
- Image acquisition with a multiplex fluorescence slide scanner.
- Protocols for both manual and automated slide preparation.
- Single-cell segmentation and spatial analysis using digital pathology software.
Main Results
- Successful multiplexed detection of multiple biomarkers within single tissue sections.
- Assessment of abundance and spatial distribution of senescent cells across diverse tissues.
- Generation of high-content multiplex datasets suitable for advanced spatial analysis.
- Protocols adaptable for both manual and automated workflows.
Conclusions
- Multiplexed IF provides a powerful, unbiased approach for senescent cell detection in situ.
- The described methods facilitate comprehensive spatial and quantitative analysis of tissue samples.
- This protocol serves as a general guide for multiplexed imaging in research and pathology applications.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence enables high-content spatial profiling of senescence markers across diverse human tissues, addressing the challenge of heterogeneous senescence signatures in drug discovery. This approach enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity by allowing simultaneous assessment of multiple biomarkers within a single tissue section. The method is positioned to improve decision-making at key inflection points in early discovery and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of senescence-associated pathways using combinatorial biomarker panels.
- Supports biological de-risking by revealing cell-type and context-specific senescence signatures.
- Facilitates predictive confidence in target selection through spatially resolved marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Standardizes multiplexed assay workflows for reproducible and quantitative biomarker detection.
- Enables scalable imaging and analysis suitable for high-throughput tissue microarray studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker data with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting unbiased senescent cell detection.
- De-risks advancement decisions by quantifying abundance and distribution of senescent cells in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed IF assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, quantitative analysis of senescence markers in human tissue microarrays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multi-marker spatial profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated tissue contexts.
- Analytics: Provides high-content imaging datasets and digital pathology outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning biomarker data with disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed imaging across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust spatial biomarker analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and digital pathology analysis.
- Needs access to multiplex slide scanners and compatible digital pathology software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to both manual and automated slide preparation workflows.
- Dependent on tissue quality and marker panel optimization for reliable outputs.
