Выделение перицитов из корковой ткани мыши с помощью FACS для секвенирования отдельных клеток

Наше исследование изучает паразитов мозга, сосредотачиваясь на их сосудистых ролях и взаимодействии в нейроваскулярном отделении для понимания функции мозга. Низкий уровень визуализации и пространственный FACS в кишечном процессе, картирование или функция паразита в сосудистой системе мозга, выявляя местоположения, специфические роли и терапевтические цели. Для начала распылите голову и шею усыплённой мыши 75% этанола.

С помощью скальпеля сделайте средний разрез на коже головы от затылочной части до лобной области, чтобы обнажить череп. Выполните поперечный разрез перед двусторонними орбитами, затем боковые разрезы вдоль нижних краёв мозжечка для отделения основания черепа. Разрезать кальварий продольно вдоль сагиттального шва от задней к передней части.

Поднимите черепный лоскут вместе с помощью дураматера, чтобы открыть мозг. С помощью хирургических ножниц аккуратно поднимают мозг, одновременно перерезайте зрительные нервы и продолговатую связь спинного мозга. Аккуратно поместите целый мозг в 10-сантиметровую тарелку с 10 миллилитрами ледяного PBS, чтобы избежать повреждений.

Перенесите мозг на алюминиевую фольгу. Обнажите субарахноидальное пространство. После удаления твердой орудости щипцом прополосните её сбалансированным соляным раствором Hank.

Перенесите салфетку на фильтрационную бумагу и удалите пиаметар, свернув их. С помощью бритвы разрежьте и отбросьте обонятельную луковицу и самые хвостовые участки, а мозг коронально разрежьте на срезы толщиной от двух до трёх миллиметров. Изолировать кору головного мозга вдоль мозолистого тела.

Перенесите кортикальную ткань в ампулы, содержащие три миллилитра буфера для сбора ледяных тканей. С помощью хирургических скальпелей измельчите ткань и ампулы на фрагменты примерно один на один миллиметр и завершите измельчение за пять минут, чтобы сохранить свежесть тканей. Наконечники пипеток перед промывкой с буфером для сбора тканей.

Затем медленно аспирируйте измельчённые фрагменты к вершине кончика, держа пипетку вертикально. Аккуратно выведите фрагменты в заранее охлаждённые 15-миллилитровые центрифугные трубки. Промой оригинальные ампулы 2% FBS в физиологическом растворе PBS.

Переведите промывку в те же центрифугные трубки и центрифугуйте при температуре 300G на пять минут при четырёх градусах Цельсия. Сбросьте супернатант после центрифугирования. Заново суспензируйте каждую гранулу в трёх миллилитрах раствора с ферментом CD.

Равномерно размените суспензию в три трубки и добавьте дополнительный ферментный раствор, чтобы достичь итогового объёма в пять миллилитров на трубку. Инкубировать трубки в гибридизационной печи при 37 градусах Цельсия в течение 100 минут с орбитальным встряхиванием при 100 G. Во время инкубации добавьте один миллилитр раствора DNASE One в 10 миллилитров 2%FBS в PBS.

Прекратите пищеварение, центрифугая при 300G при четырёх градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем заново суспензировать каждую гранулу в одном миллилитре раствора для диссоциации тканей. Пипетить раствор 100 раз для помощи в механической диссоциации.

Далее соберите все подвески в одну 50-миллилитровую трубку центрифуги. Прополосните каждую тюбик двумя миллилитрами буфера и комбинируйте промывки. После центрифугирования при 300G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия и удаления верхнего слоя добавьте 12,5 миллилитра 20% BSA и инвертируйте для смешивания.

Центрифуга при 1000 G при четырёх градусах Цельсия в течение 20 минут. Теперь соберите нижню гранулу и переложите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку центрифуги. Аккуратно подвесьте перед центрифугированием.

Заново суспензируйте каждую гранулу в двух миллилитрах 2% FBS в PBS. Затем объедините обе подвески в одну трубу. Центрифугуйте комбинированную подвеску при температуре 300G при четырёх градусах Цельсия на пять минут.

После удаления супернатанта последнюю гранулу снова суспензируйте в двух миллилитрах PBS с 2% FBS. Приготовьте четыре 15-миллилитровые центрифугные трубки с четырьмя миллилитрами раствора 22% на один вызов. Аккуратно нанесите 0,5 миллилитровых аликвотов суспензии клетки на каждый градиент и центрифугуйте при температуре 560G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

После аспирации супернатанта заново суспензируйте каждую гранулу в одном миллилитре глюкозного буфера HBSS BSA. Затем втяните подвески в новую трубку на 15 миллилитров. Промывайте перкольные трубки двумя миллилитрами буфера и смешайте промывки перед центрифугированием при 300 Г в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия.

Для циркуляционной цитометрии ре-суспензировать гранулу в одном миллилитре глюкозного буфера HBSS BSA после аспирации супернаданта. Добавьте пять микролитров реагента, блокирующего FC-рецепторы, и инкубируем при четырёх градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем пипетка флуоресцентно конъюгировала антитела к суспензии перед инкубацией.

Промой клетки шестью миллилитрами глюкозного буфера HBSS BSA. Затем центрифугуйте подвеску при 300G при четырёх градусах Цельсия в течение пяти минут. После аспирации супернатанта снова подвесьте гранулу в одном миллилитре буфера.

Добавьте 200 микролитров семи аминоактиномицина D раствора и инкубируем на льду в течение 10 минут. Затем отрегулировать конечный объём до двух миллилитров с буфером HBSS, дополненным BSA и глюкозой. Прополосните внутреннюю поверхность сортировочных пробирок раствором 1% BSA.

Аспирируйте лишний раствор, оставляя ровно один миллилитр раствора в каждой трубке. Храните трубки на льду, чтобы получить отсортированные клетки. Клетки, диссоциированные от мозговой ткани, последовательно контролировались по площади рассеяния впереди и боковым участкам рассеяния, чтобы исключить клеточный мусор во время сортировки цитометрией потока.

Были исключены положительные события с CD45 и CD41 положительными с двойным положительным результатом для удаления гемопоэтических клеток и тромбоцитов. Были обогащены положительные сосудистые стенки CD13. Апоптотические клетки были исключены с помощью семи аминоактиномициноотрицательных D-отрицательных гейтингов, за которыми следовал CD31-отрицательный отбор для выделения паразитов.

Сортировка потоковой цитометрии показала, что нуклеированные клетки составляют 59,8% всех событий. Положительные клетки CD13 составляли 1% всех событий. А итоговая популяция отрицательных паразитов CD13 составила 0,7% всех случаев.

Уменьшение размерности UMAP отсортированных клеток выявило шесть различных основных кластеров, указывающих на клеточную гетерогенность внутри изолированной популяции. Анализ тепловой карты, нормализованный Z-score, показал, что гены маркеров паразитов экспрессируются высоко и преимущественно в кластерах от нуля до третьего. Анализ пропорции кластеров показал, что кластеры от нуля до третьего составляют 87,1% от общей численности населения.

В то время как маркеры гладкомышечных клеток обогащались в четвёртом кластере с 10,14%, а маркеры фибробластов — в пятом кластере — 2,77%, этот протокол позволяет исследователям выделять носимые паразиты высокой чистоты, подходящие для последующей секвенирования отдельных клеток и функционального анализа. Основная проблема — отсутствие высокоспецифических маркеров паразита, сложность изоляции и повышение риска секулярного заражения. Будущие исследования могут быть сосредоточены на выявлении паразитоспецифических маркеров, что позволит улучшить изолят, углубить функциональную характеристику и провести целенаправленные терапевтические исследования.