Стандартизированный метод обнаружения туннельных нанотрубок в клетках кожи человека для применения в тканевой инженерии

Мы разработали методы для надёжного обнаружения и анализа туннельных нанотрубок между клетками человеческой кожи и изучения их потенциальной роли в регенерации кожи. Наш протокол разработан для фиксированных образцов или первичных клеток кожи человека. Он полезен в исследованиях, связанных с биологией кожи и регенерацией тканей.

Для начала оттаяйте и культивируйте эпидермальные кератиноциты человека и дермальные фибробласты в 60-миллиметровых антеннах с соответствующей средой роста. Дополните культуры кератиноцитов Y-27632 до конечной концентрации в пять микромоляров во время реанимации. Поддерживайте все культуры при 37 градусах Цельсия в увлажнённом инкубаторе, пока они не достигнут примерно 80% совпадения.

Затем уберите среду из чашки для культуры. Кратковременно промывайте клетки одним миллилитром PBS, чтобы поддерживать физиологический pH и осмолярность во время мытья. Полностью аспирируйте PBS.

Добавьте один миллилитр 0,05% трипсина ЭДТА и равномерно распределите его по поверхности клетки. Инкубировать блюдо при 37 градусах Цельсия в течение 1,5–2,5 минут. Аккуратно подвесьте клетки, поднимая и опуская трубу.

Добавьте два миллилитра растительной среды для нейтрализации трипсина. Перенесите суспензию элемента в 15-миллилитровую трубку и центрифугуйте при 200 G на пять минут при комнатной температуре. После центрифугирования сбросьте супернатант из центрифугной трубки.

Суспензируйте клеточную гранулу в один-два миллилитра среды и посчитайте клетки с помощью автоматического счётчика. Далее в каждую ячейку восьми-камерного слайда засекают 12 000 дермальных фибробластов или 20 000 кератиноцитов в итоговом объёме 400 микролитров. После посева хорошо перекрёстно встряхните камеру, чтобы равномерно распределить клетки, и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия примерно в течение 24 часов.

После инкубации убедитесь, что слияние клеток составляет около 80% под микроскопом. Когда культуры достигают 80% совпадения, аккуратно добавляйте несколько капель фиксирующего раствора прямо в камеру для префиксации клеток. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение четырёх минут, чтобы фиксатор равномерно распространялся без нарушения клеток.

Затем аспирируйте префиксатив из скважины и добавьте 140 микролитров свежего фиксирующего раствора, обеспечивая полное покрытие поверхности скважины. Инкубировать горку при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем удалите фиксатор из камеры и добавьте 140 микролитров 100-миллимолярного хлорида аммония для закалки остаточных альдегидов.

Инкубировать слайд при комнатной температуре 10–30 минут. Промывайте образцы три раза PBS по 30 секунд при комнатной температуре. Во время каждого промывания аккуратно пипетируйте буфер вдоль стенки камеры, чтобы избежать смывания клеток или повреждения туннельных нанотрубок.

Инкубировать клетки с помощью 140 микролитров объёмного разбавления 1:300 агглютинина зародышей пшеницы Alexa Flour в PBS. Проведите инкубацию в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут для маркировки гликопротеинов плазматической мембраны для визуализации туннельных нанотрубок, полученных из мембраны. Затем промывайте клетки три раза PBS по 30 секунд каждая.

Затем инкубировать клетки 140 микролитрами фаллоидина конъюгата, разбавленных от одного до 250 раз в 1% BSA в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. После трёхкратной промывки клеток PBS инкубируют их с 140 микролитрами раствора DAPI в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте. Затем добавьте по две-три капли монтажного материала в каждую скважину и инкубуйте образец при комнатной температуре в течение 20 минут.

Храните слайды при температуре четырёх градусов Цельсия в темноте минимум 20 минут до проведения визуализации. В культурах дермальных фибробластов наблюдались туннельные нанотрубки как длинные тонкие выступы, соединяющие соседние клетки с мембранами, окрашёнными агглютинином зародыша пшеницы и F-актином, помеченными фаллоидином. В культурах эпидермальных кератиноцитов также наблюдались туннельные нанотрубки с характерными F-актин-положительными выступами, соединяющие соседние клетки.

В кокультурах дермальных фибробластов и эпидермальных кератиноцитов туннельные нанотрубки постоянно обнаруживались между дермальными фибробластами и эпидермическими кератиноцитами, визуализируемые с помощью мембранного и цитокератин-5-окрашивания. Туннельные нанотрубки в совместных культурах демонстрировали разнообразную цитоскелетную организацию, при этом в примерах содержался только F-актин, обе нити, F-актин с частичным альфа-тубулином или низкий уровень альфа-тубулина. Главная задача — сохранить туннель в нанотрубках.

Это требует аккуратной фиксации, правильного тайминга и использования свежеприготовленных фиксированных добавок. С помощью нашего протокола можно измерять тоннельные нанотрубки при различных клеточных условиях для изучения их потенциальных функций. В будущем мы будем флуоресцентно маркировать митохондрии для изучения их переноса через туннельные нанотрубки.