Анализ формирования колоний для выявления пролиферативной способности клеток остеосаркомы, вызванных LncRNA-knockdown
16 января 2026 г.
Этот экспериментальный протокол обеспечивает стабильный, экономичный и эффективный метод, сочетающий уничтожение LncRNA с анализами на формирование колоний для количественной оценки влияния lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы.
Мои исследования сосредоточены на остеосаркоме и направлены на изучение того, как LncRNA knockdown влияет на долгосрочную пролиферативную способность с помощью анализов колоний. Для начала засеяйте 5 раз по 10 на мощность 5 клеток остеосаркомы 143B в две культивные чаши по 10 сантиметров. Культивировать клетки в полном DMEM с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с 5% углекислого газа.
Подготовьте трансфекционные реагенты через 24 часа, включая плазмиды, полиэтиленимин и OptiMinium Essential Medium. Закрутите каждый реагент и дайте им уравновеситься до комнатной температуры перед использованием. Теперь промаркируйте четыре микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 миллилитра для плазмид и полиэтиленимина маркерной ручкой.
Пипетка — 500 микролитров OptiMinium Essential Medium на каждую пробирку. Затем добавьте 10 микрограммов плазмиды в соответствующую пробирку плазмиды и пипетку 30 микролитров полиэтиленимина в каждую полиэтилениминовую трубку. Аккуратно перемешайте каждую трубку, пипетируя вверх и вниз, и инкубируйте.
Теперь объедините каждую плазмидную трубку с соответствующей полиэтилениминовой трубкой. Аккуратно перемешайте и инкубуйте смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. Аккуратно аспирируйте культурную среду из тарелок с 143B-клетками.
Добавьте семь миллилитров безсывороточного средства в каждую порцию и маркируйте блюда в зависимости от добавленного плазмида. Добавьте подготовленную смесь для перемещения по капле в соответствующую чашу для культуры. Добавляйте смесь медленно круговыми движениями от внешнего края к центру блюда.
Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа. Сбросьте супернатант через 8–12 часов. Затем добавьте 10 миллилитров полного DMEM в миску и инкубируете.
Наблюдайте клетки под флуоресцентным микроскопом через 72 часа после замены среды, убирайте среду из контейнеров для культуры. Добавьте 1,5 миллилитра кислоты трипсин-ЭДТА для переваривания клеток. Клетки мягко пипетят, чтобы отделить клетки.
Затем добавьте пять миллилитров полной среды, чтобы прекратить пищеварение. Перенесите суспензию элемента в 15-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Затем пипетка 20 микролитров клеточной суспензии в гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки.
Соберите 3 раза по 10 на мощность 5 ячеек для экстракции рибонуклеиновой кислоты, чтобы проверить эффективность сбивания. Теперь посев 2 раза по 10 на мощность 3 ячейки на каждую скважину в пластину с шестью ямецами. Пипетта завершила DMEM до финального объёма в два миллилитра.
Культивируйте клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с 5% углекислого газа. Ежедневно следите за формированием колонии. Заканчивайте культуру, когда большинство колоний контрольной группы содержат не менее 50 клеток или после 10–14 дней инкубации.
После выброса супернатанта промыйте клетки дважды одним миллилитром PBS на каждую яму, а раствор после каждой промывки выбрасывают. Зафиксируйте клетки в одном миллилитре раствора 10% формалина на 15 минут. Сбросьте фиксатор, затем дважды промой клетки с помощью одного миллилитра на каждую ячейку PBS.
Покрасьте клетки одним миллилитром раствора 0,5% кристаллической фиолетовой в течение 10–30 минут. Затем аккуратно помойте тарелку медленно текущей водопроводной водой. Ячейки сушат на воздухе при комнатной температуре.
Снимайте колонии с помощью камеры. Эффективность трансфекции клеток 143B была подтверждена флуоресцентной микроскопией через 72 часа после трансфекции, что свидетельствует о эффективной доставке плазмид в обоих условиях. RT-qPCR-анализ показал, что экспрессия SNHG6 была значительно снижена в 143B-клетках, трансфектированных shSNHG6, по сравнению с группой shNC.
Анализы формирования колоний показали значительное уменьшение количества и размера колоний в группе SNHG6 по сравнению с контрольной группой. Этот протокол оценивает долгосрочную пролиферацию отдельных клеток, обеспечивая более высокую биологическую значимость и более определённые результаты, чем краткосрочные метаболические пролиферационные анализы. Будущие исследования расширят этот протокол на дополнительные LncRNA и модели опухолей для систематического изучения механизмов, регулирующих пролиферативный потенциал раковых клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном экспериментальном протоколе описан метод исследования влияния нокдауна lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы с помощью анализа формирования колоний. Данный подход разработан как стабильный, экономичный и эффективный.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретическая часть
- Остеосаркома — это тип рака костей, который поражает преимущественно подростков и молодых людей.
- Длинные некодирующие РНК (днкРНК) играют важную роль в регуляции экспрессии генов и клеточных процессов.
- Понимание роли днкРНК в раке может дать представление о потенциальных терапевтических мишенях.
- Анализы на колониеобразующую способность необходимы для оценки долгосрочного пролиферативного потенциала раковых клеток.
Цель исследования
- Количественно оценить влияние нокдауна lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы.
- Разработать надежный протокол проведения анализа колониеобразующей способности в данном контексте.
- Изучить механизмы регуляции пролиферации раковых клеток посредством взаимодействий lncRNA.
Используемые методы
- Трансфекция клеток остеосаркомы 143B плазмидами, нацеленными на lncRNA.
- Использование безсывороточной среды для трансфекции с последующим культивированием в полном DMEM.
- Анализ формирования колоний для мониторинга пролиферации клеток в течение 10–14 дней.
- Флуоресцентная микроскопия и RT-qPCR для оценки эффективности трансфекции и уровней экспрессии lncRNA.
Основные результаты
- Значительное снижение экспрессии SNHG6 в трансфицированных клетках по сравнению с контролем.
- Анализ формирования колоний показал уменьшение количества и размера колоний в группе с нокдауном lncRNA.
- Протокол продемонстрировал более высокую биологическую релевантность по сравнению с краткосрочными анализами.
- Будущие исследования распространят данный подход на другие lncRNA и модели опухолей.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно оценить влияние lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы.
- Он создает основу для дальнейших исследований функций lncRNA в биологии рака.
- Результаты указывают на то, что нокдаун lncRNA может существенно влиять на рост и жизнеспособность раковых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной индустрии
Анализы колониеобразования представляют собой надежную платформу для оценки долгосрочной пролиферативной способности клеток остеосаркомы после нокдауна lncRNA, что имеет непосредственное значение для валидации мишеней и снижения механистических рисков в рамках процессов поиска новых онкологических препаратов. Количественная оценка пролиферации единичных клеток позволяет с высокой степенью достоверности дифференцировать функциональные и нефункциональные мишени lncRNA, что способствует принятию обоснованных решений по управлению портфелем проектов с учетом рисков. Данный рабочий процесс широко применим для оценки пролиферации, регулируемой lncRNA, на различных моделях опухолей, что обеспечивает преемственность трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Позволяет проводить функциональный анализ мишеней lncRNA в моделях остеосаркомы, имеющих значение для изучения заболевания.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между нокдауном lncRNA и количественными изменениями пролиферативной способности.
- Облегчает приоритизацию кандидатов lncRNA для дальнейшей доклинической оценки.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать воспроизводимый количественный анализ долгосрочной пролиферации клеток.
- Обеспечивает стандартизированные результаты для сравнительного анализа эффектов нокдауна lncRNA.
- Обеспечивает надежную оценку влияния соединений или генетических нарушений на формирование колоний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты пролиферации in vitro с биологией опухоли, имеющей значение для заболевания.
- Обеспечивает преемственность от этапа валидации мишени при поиске до выбора доклинической модели.
- Способствует разработке биомаркеров путем установления связи между экспрессией lncRNA и функциональными клеточными исходами.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, предоставляя валидированный метод функциональной оценки мишени и количественного определения пролиферативного потенциала.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы о функции lncRNA в пролиферации клеток остеосаркомы.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные и воспроизводимые данные о формировании колоний для отбора перспективных кандидатов.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения количества и размера колоний для статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с выбором моделей in vivo и стратегиями поиска биомаркеров.
- Повторное использование в масштабах предприятия: предлагает масштабируемый метод анализа, адаптируемый для других lncRNAs и типов опухолей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней lncRNA и снижает неопределенность механизмов действия.
- Операционная ценность: Стандартизирует оценку долгосрочной пролиферации с высокой воспроизводимостью и масштабируемостью.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и распределение капитала за счет предоставления окончательных функциональных данных.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней lncRNA для дальнейшего продвижения с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области культивирования клеток, трансфекции и количественного анализа проб.
- Необходим доступ к оборудованию для флуоресцентной микроскопии, RT-qPCR и визуализации колоний.
- Требуется межгрупповая стандартизация подготовки анализа и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован для различных линий опухолевых клеток и мишеней lncRNA путем оптимизации протокола.
- Результаты зависят от проведения надежного статистического анализа для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
