Разработка нановезикул с мембраной мезенхимальных стволовых клеток для усиленной доставки генов

В этом протоколе мы предлагаем метод подготовки нановезикул, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, которые напоминают внеклеточные везикулы и инкапсулируют AAV для улучшения доставки генов. Мы называем это нановезикулами, содержащими AAV, CME-AAV. По сравнению с новым вектором доставки генов EV-AAV, CME-AAV обеспечивают большую гибкость в источниках клеток и более высокий выход.

Для начала удалите культурную среду из культурной чаши, содержащей человеческие мезенхимальные стволовые клетки при совпадении от 70 до 90%. С помощью скребка отсоедините клетки от контейнера и переместите их в коническую трубку с PBS. Центрифугуйте собранные клетки при температуре 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия, чтобы пеллетировать клетки.

Затем дважды промой клеточную гранулу с помощью PBS и снова центрифугой. Суспензировать последнюю клеточную гранулу в PBS с добавлением коктейля с ингибиторами протеазы. Затем подвергайте суспензию клетки трём циклам замораживания и оттаивания, чтобы нарушить работу плазматической мембраны и получить примитивный лизат.

С помощью пипетки тщательно гомогенизуйте лизат. Затем центрифугуйте при 1 000 г в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Перенесите супернатант в новую трубку.

Центрифуга при 18 000 г в течение часа при 4 градусах Цельсия для гранулирования фракции мембраны. Отбросьте супернатант и повторно суспензуйте мембранную гранулу в PBS, чтобы получить примитивную фракцию мембраны мезенхимальных стволовых клеток. Теперь униформируйте мембранную суспензию, последовательно пропуская её через шприцы с иглами калибра 20–27.

Определите концентрацию белка в гомогенизированной мембранной суспензии с помощью анализа на бицинхониновую кислоту. Аликвот подвеску и храните при минус 80 градусах Цельсия, пока не понадобится. После каждого цикла разморозки повторно гомогенизуйте суспензию с помощью шприца 27 калибров.

Смешайте подготовленную мембранную суспензию с аденоассоциированным вирусом (AAV) в соотношении 150 микрограммов белка на один раз на 10 к мощности 10 копий генома. Инкубировать смесь при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с аккуратным встряхиванием. Загрузите мембрану и вирусную смесь в мини-экструдер, оснащённый 400-нанометровой поликарбонатной мембраной.

Пропустите смесь через экструдер 20 раз, чтобы обеспечить инкапсуляцию. Замените мембрану диаметром 400 нанометров на мембрану 200 нанометров и повторите экструзию. Соберите процессную суспензию, содержащую инкапсулированный вирус, а также неинкапсулированный вирус и пустые пузырьки.

При необходимости объединяйте несколько партий и сразу переходите к очистке. Разведите стандартный раствор йодиксанола 10x PBS и стерильной деионизированной водой, чтобы получить растворы с содержанием 40 и 25%. С помощью пипетки добавьте один миллилитр 40% йодиксанола на дно 13,2-миллилитровой тонкостенной ультрапрозрачной трубки.

Затем наложите три миллилитра 25%йодиксанола поверх слоя 40%, чтобы получить прерывистый градиент. Аккуратно наложите семь миллилитров обработанной суспензии на верхнюю часть градиента. Сбалансируйте трубы и загрузите их в сверхцентрифугный ротор.

Центрифуга при 150 000 г в течение трёх часов при 4 градусах Цельсия, используя быстрое ускорение и медленное замедление. Затем аккуратно снимите трубки, не нарушая градиент. Соберите одну миллилитровую фракцию сверху донизу в маркированные микроцентрифугальные трубки объемом 1,5 миллилитра.

Держите все дроби на льду. Теперь определите и объедините семь и восьмые фракции, содержащие очищенные CME-AAV, в новую открытую ультрацентрифугную трубку. Увеличите объём до 11 миллилитров с помощью PBS.

Затем аккуратно перемешайте пипеткой на один миллилитр. Используя быстрое ускорение и замедление, центрифугуйте собранные фракции при 150 000 г в течение трёх часов при четырёх градусах Цельсия. Аккуратно отбросьте супернатант.

Суспензировать гранулу в 50–200 микролитрах стерильного PBS, в зависимости от желаемой концентрации. Аликот — очищенное блюдо. Затем храните при 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования.

Подготовьте рабочие растворы инкапсулированного вируса и контроля в стерильной PBS. Добавляйте равные копии генома инкапсулированного вируса или контрольного вируса непосредственно в культурную среду в каждой колодце. Включайте отрицательные контрольные скважины с эквивалентным объёмом PBS или пустые вирусные частицы.

Аккуратно покрутите пластину для равномерного распределения и инкубировать в течение 24–72 часов, в зависимости от экспериментального дизайна. Далее аккуратно вдых в культурную среду. Промыйте клетки дважды с помощью PBS, не сдвинув их.

Окрашивайте ядра Hoechst 33342 согласно инструкции производителя. Проведите флуоресцентную визуализацию живых клеток с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами для усиленного зелёного флуоресцентного белка и Hoechst. Выберите объективы 10x или 20x для количественной оценки и объектив 63x для высокоразрешающей съёмки, если это необходимо.

Получите не менее пяти полей обзора на каждую скважину, используя одинаковые параметры изображения. Сохраняйте все изображения в raw и gray форматах для количественного анализа. Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что CME-AAV имеют размеры и мембранно-связанные структуры, похожие на внеклеточные везикулы.

Мембранные маркеры мезенхимальных стволовых клеток, CD73 и CD90, были обнаружены в CME-AAV методом анализа Western blot. Три основных аденоассоциированных вирусных капсидных белка — VP1, VP2 и VP3 — были идентифицированы в CME-AAV методом SDS-PAGE. Анализ NanoSight показал, что CME-AAV9.

Средний диаметр EGFP составлял 128,6 нанометра и общая концентрация частиц 1,32 умножить на 10 при мощности 10 частиц на миллилитр. Флуоресцентная микроскопия показала, что CME-AAV9. EGFP обеспечил значительно более высокий уровень экспрессии зелёного флуоресцентного белка в HEK293T клетках.

Вирус, покрытый мембраной, достиг примерно в 2,5 раза выше экспрессии генов, что указывает на усиленное клеточное поглощение и потенциально улучшение внутриклеточного трафика. Биолюминесцентная визуализация in vivo показала, что печень проявила самый сильный люминесцентный сигнал после введения CME-AAV. Количественный анализ областей печени показал, что введение CME-AAV приводило к значительно более высокому уровню экспрессии генов.

Эти протоколы описывают шаги получения очищенных AAV, покрытых мембраной клеток, или CME-AAV, посредством экструзии и ультрацентрифугирования градиента плотности. Два ключевых фактора требуют тщательного рассмотрения: предварительной обработки фрагментов клеток для экструзии и оптимизации соотношения мембранных фрагментов к AAV для контроля соотношения частиц к геному CME-AAV. Будущие исследования могут дополнительно изучить оболочку клеточной мембраны для усиления иммунной защиты и функциональных поверхностных свойств, оптимизируя CME-AAV как универсальную платформу для доставки AAV.