Создание первичных культур, обогащённых зонами, из коры надпочечников мышей

Мои исследования изучали регуляцию микроокружения надпочечников, с акцентом на сигнализацию ACM и Wnt в зоне гломерулозы и зонной пучке, а также развитие опухолей. Существующие методы не могут чётко различать надпочечники. Этот протокол обогащает ZG и ZF, позволяя изучать различные типы клеток.

Этот протокол может применяться для изучения адренофизиологии в ZG и ZF, включая зонирование и дифференцировку клеток. Для выделения надпочечников для первичной культуры, обогащённой по зонам, используйте 10–15 молодых взрослых мышей-самцов примерно в возрасте от шести до семи недель. После эвтаназии мыши поместите её в спинное положение декубитус на стерильной плоской поверхности и продезинфицируйте шерсть животного 70% спиртом.

С помощью ножниц сделайте начальный разрез в паховой области живота. Удлините разрез латерально к груди с обеих сторон, чтобы обнажить брюшину. Аккуратно оттяните кожу.

Затем аккуратно втяните мышцы брюшной полости, чтобы открыть полость, избегая повреждения кровеносных сосудов и поддерживая чёткое визуализирование надпочечников. Замените хирургические инструменты, чтобы минимизировать микробное загрязнение. Определите левую надпочечниковую железу, расположенную медиально и выше левой почки в ретробрюгионеуме, с овальной формой и розовой окраской, окружённой белой жировой тканью.

С помощью тупых щипцов аккуратно перемещайте соседние органы для улучшения визуализации надпочечников. С помощью ножниц удалять большую часть окружающей жировой ткани короткими контролируемыми разрезами, чтобы изолировать надпочечник. Избегайте прямого захвата надпочечников, чтобы предотвратить повреждение её капсулы.

Немедленно поместите изолированную надпочечницу в контейнер P60 с 10 миллилитрами предварительно нагретой среды DMEM F-12, пока не будут собраны все образцы. Далее определите правую надпочечниковую железу, расположенную латерально и выше правой почки в ретробрютионеуме, отметив, что её близость к печени, восходящей кишке и близлежащим кровеносным сосудам может усложнять визуализацию. Аккуратно обращайтесь с почечными и артериями, чтобы избежать случайных порезов и кровотечений.

После выделения правой надпочечниковой железы, используя ту же процедуру, что и левую надпочечницу, разместите обе железы вместе в одной чашке. Протрите посевную чашу 70% спиртом перед тем, как переместить железы в ламинарный вытяжку. Затем промыйте надпочечники три раза, последовательно перемещая их через посуду с PBS при 25 градусах Цельсия.

После финальной промывки соберите и удержите отделённые ткани в четвертой чаше с предварительно нагретым DMEM, чтобы сохранить жизнеспособность при приготовлении нескольких желез. Перенесите надпочечники на фильтрационную бумагу для вскрытия. Далее, используя тонкие щипцы, захватите надпочечник за приклеенную жировую ткань.

Аккуратно разобрайте жир на фильтровой бумаге контролируемыми движениями, чтобы не повредить капсулу. Убедитесь, что железа гладкая, целая и свободна от избытка жира и соединительной ткани. Аккуратно перенесите надпочечники на свежую фильтрующую бумагу для обеспечения точной микродиссекции.

С помощью тонких щипцов аккуратно зажмите капсулу надпочечников. С помощью скальпеля сделайте радиальный разрез в железе, не перерезая ткань полностью. Примените небольшое механическое давление, чтобы вывести внутреннее содержимое коры наружу через разрез.

Обнажить внутреннюю железистую ткань, при этом держать капсулу и зону гломерулозу соединенными с кончиком щипцов. Идентифицируйте выделенный внутренний железистый материал как зону пучока и медуллу. Ферментативное переваривание можно начать только после обработки всех желез, чтобы обеспечить правильное механическое разделение внешней и внутренней зон.

После центрифугирования вновь суспензировать собранные клетки в культурной среде. После формирования культуры надпочечниковых клеток проводите молекулярную характеристику культивируемых клеток с помощью анализа экспрессии генов и иммунного окрашивания. Первичные культуры надпочечников были успешно установлены из внешней фракции, обогащённой для клеток зонагломерулёза, и внутренней фракции для клеток зонной пуцкулаты.

Модель мышей с отслеживанием линии позволила визуализировать специфическую для зоны гломерулозу экспрессию mGFP, обусловленную промотором Cyp11b2. Экспрессия mGFP преимущественно наблюдалась в культурах, обогащённых zonaglomerulosa, тогда как культуры, обогащённые зонными пучками, преимущественно экспрессировали mTomato. Более высокие относительные уровни экспрессии Cyp11b2, Dab2 и Sonic hedgehog были зафиксированы в наружных фракционных культурах по сравнению с культурами внутренней фракции.

Культуры внутренней фракции показали более высокую относительную экспрессию Cyp11b1, а Akr1b7 — по сравнению с культурами с внешними фракциями. Секреция альдостерона была выше в культурах, обогащённых зонагломерулозой, чем в культурах, обогащённых зонами пучок. В культурах с внешней фракцией секреция альдостерона дополнительно увеличивалась при стимуляции ангиотензином II, калием и адренокортикотропными гормонами.

Секреция кортикостерона была выше в культурах, обогащённых фасцикулатами, по сравнению с культурами, обогащёнными гломерулозой. Культуры, обогащённые фасцикулатами зоны, показали повышенную секрецию кортикостерона в ответ на стимуляцию адренокортикотропного гормона и форсколина. Этот протокол позволяет изучать зоноспецифическую физиологию и дифференциацию, включая выработку гормонов, сигнальный путь и внеклеточный матрикс.

Будущие исследования могут исследовать механизмы зонирования и дифференцировки надпочечников, а также использовать эти клетки для построения 3D-модели и изучения взаимодействий ЭКМ.