Одноместный Электропорация сотовых в естественных условиях в течение Неповрежденный развивающийся мозг

Электропорация отдельных клеток представляет собой специализированный метод, позволяющий вводить ДНК или другие макромолекулы в отдельные клетки в пределах целостной ткани, включая препараты in vivo при сочетании с передовыми методами визуализации in vivo. Электропорация отдельных клеток флуоресцентными маркерами позволяет напрямую визуализировать морфологию клеток, их рост и межклеточные взаимодействия в интервалах времени от нескольких секунд до нескольких дней. В данном видео мы подробно описываем процедуру электропорации флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны неповрежденного мозга головастика XUS и приводим примеры прижизненной визуализации флуоресцентно меченых нейронов.

Здравствуйте. Меня зовут Эт Хаа, я работаю в лаборатории доктора Курта Хааса в Центре исследования мозга Университета Британской Колумбии. Сегодня я продемонстрирую, как проводить таргетную электропорацию отдельных нейронов в неповрежденном мозге головастика альбиноса XUS Lavis.

Отличительным преимуществом данного метода является возможность проведения экспериментальных манипуляций с отдельными клетками без изменения окружающей ткани, что позволяет дифференцировать клеточно-автономные эффекты от эффектов, вызванных общим воздействием. Первый этап включает изготовление микропипеток с подходящим диаметром кончика и углом конуса, после чего в микропипетку вносится переносимый материал. Затем пулы TA необходимо анестезировать и перенести в камеру фиксации, после чего в мозг вводится микропипетка и подается серия импульсов напряжения.

Наконец, визуализация меченых нейронов проводится с помощью двухфотонной микроскопии. Вам продемонстрируют эту методику на головастиках. Маркировка одиночных клеток может быть использована и в других модельных системах, а также в препаратах ex vivo.

Учитывая это, приступим к работе. Электропорация единичных клеток осуществляется воздействием на отдельную клетку с помощью вытянутого стеклянного микропипеточного электрода, который ограничивает электрическое поле одной клеткой, контактирующей с кончиком пипетки. Физическая геометрия кончика пипетки является критическим параметром, напрямую влияющим на успех данной методики.

Для изготовления микропипеток из боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,75 мм, содержащего внутреннюю нить для облегчения заполнения кончика без образования пузырьков воздуха, используется вытягиватель Solder модель P 97. Наиболее эффективными для электропорации одиночных клеток оказались пипетки с диаметром кончика от 0,5 до 1 мкм и углом конуса более 10 градусов. После вытягивания стеклянной микропипетки переносимый материал в растворе может быть введен в пипетку путем обратного заполнения или с помощью шприца для загрузки.

В данном демонстрационном опыте мы будем проводить флуоресцентное мечение отдельных нейронов с помощью флуоресцентного красителя, представленного здесь, или плазмиды, кодирующей GFP (зеленый флуоресцентный белок). Растворы следует подвергнуть кратковременному центрифугированию на высокой скорости, чтобы уменьшить количество твердых частиц, которые могут попасть в пипетку. Поскольку наличие таких частиц повышает вероятность засорения наконечника, новым пользователям рекомендуется начать работу с флуоресцентными красителями, так как их легко обнаружить при эпифлуоресцентной микроскопии.

Это позволяет визуализировать кончик пипетки внутри образца и дает прямую обратную связь о том, правильно ли настроено оборудование и подходит ли выбранный наконечник дозатора. Отлично. Теперь, когда мы подготовили микропипетку, можно переходить к выполнению процедуры электропорации единичных клеток.

Электрическое оборудование, необходимое для данного метода, включает стимулятор, осциллограф и держатель для пипетки, оснащенный серебряной проволокой для вставки в пипетку. В данной работе используется ax separator 800 A компании Axon Instruments, однако также могут быть использованы распространенные стимуляторы, такие как Grass SD-9.

Внешний заземляющий электрод головастика представляет собой обычную серебряную проволоку, которая обеспечивает электронный контакт с головастиком. Во время электропорации головка усилителя, заземляющий провод и внешний заземляющий электрод головастика подключаются к входу осциллографа. После настройки электрооборудования пипетку можно поместить в держатель для пипеток.

Держатель пипетки должен быть установлен на трехосевом микроманипуляторе, обеспечивающем точное перемещение. Для электропорации одиночных клеток требуется микроскоп с достаточным рабочим расстоянием. Это обеспечивает больше пространства для маневра и позволяет подводить пипетку под углом примерно от 30 до 45 градусов.

После правильного подключения оборудования можно приступать к процедуре электропорации единичных клеток. Сначала головастиков анестезируют путем погружения в 0.02%MS 2, 2 2, обычно головастики полностью анестезируются. Примерно через пять минут одного головастика переносят в камеру для электропорации.

Используя пластическую переносную пипетку, камеру можно легко изготовить самостоятельно, вырезав в небольшом силиконовом блоке полость в форме головастика и вставив серебряный заземляющий провод так, чтобы он соприкасался с кожей головастика при нахождении в камере. Затем, используя кисть для позиционирования головастика, следует убедиться, что он расположен спинной стороной вверх. После этого микропипетку опускают до тех пор, пока она не коснется кожи непосредственно рядом с областью интереса.

При дальнейшем опускании пипетка сначала создаст углубление в коже, а затем пройдет в подлежащую ткань. В данном случае моей целью является зрительный бугорок мозга головастика. В частности, я целюсь в область слоя тел клеток.

При использовании xi можно контролировать сопротивление пипетки в ткани. Как правило, сопротивление в диапазоне от 10 до примерно 40 МОм является оптимальным.

Сопротивление пипетки является хорошим индикатором того, слишком ли мал диаметр кончика или забит ли он, в таких случаях сопротивление будет высоким. С другой стороны, если диаметр кончика слишком велик или кончик сломан, сопротивление пипетки будет низким. Абсолютное сопротивление пипетки невозможно измерить при использовании обычного стимулятора.

Показания осциллографа являются косвенной мерой сопротивления пипетки для флуоресцентных декстрановых красителей. Стимул представляет собой 10 миллисекундную серию положительных прямоугольных импульсов, подаваемых с частотой 300 hertz. Продолжительность отдельных импульсов составляет 300 microseconds, напряжение подачи — 50 volts.

При использовании этих настроек флуоресцентный краситель выбрасывается из кончика пипетки, что можно наблюдать при подаче стимула после электрозондирования. После этого пипетку извлекают, и процесс повторяют в различных участках ткани для повышения выхода. Во время подачи серии импульсов напряжения следует контролировать амплитуду возникающих импульсов на осциллографе и, при необходимости, отрегулировать амплитуду до значения от 1 до 1.5 microamps.

Если амплитуда импульса остается низкой после существенного увеличения напряжения или снижается в ходе процедуры, это может свидетельствовать о засорении кончика или о том, что диаметр кончика слишком мал. Подобные ситуации могут вызвать определенные затруднения. С другой стороны, если амплитуда остается высокой после существенного снижения приложенного напряжения или возрастает в ходе процедуры, это явно указывает на то, что кончик либо слишком широкий, либо поврежден или сломан.

Я часто становлюсь очень эмоциональным и грустным. Как упоминалось ранее, преимущество использования флуоресцентных красителей заключается в том, что можно сразу проверить, были ли отдельные клетки электропорированы при заданных параметрах стимуляции. Если клетки кажутся очень тусклыми или не маркированы вовсе, следует начать с постепенного и независимого увеличения каждого параметра стимуляции до тех пор, пока маркированные клетки не станут светиться ярко, как здесь; вид красиво маркированных клеток делает мой день.

С другой стороны, если окажется, что была помечена слишком большая часть клеток, следует постепенно снижать параметры стимуляции до тех пор, пока не будет достигнут результат, при котором ярко помечена одна клетка, как в данном примере. Наблюдение за ярко помеченными клетками приносит большое удовлетворение. В случае с плазмидной ДНК используются серии отрицательных импульсов длительностью 1 ms с частотой 300 Hz и общей длительностью серии 500 ms.

После электропорации головастиков переносят в свежий раствор для выращивания, где они быстро восстанавливаются после анестезии. Как правило, после проведения процедуры электропорации для 50–100 головастиков можно приступать к их скринингу, который я продемонстрирую далее. Перед началом экспериментов по визуализации целесообразно провести быстрый скрининг электропорированных головастиков с помощью вертикального эпифлуоресцентного микроскопа.

Чтобы определить, в каких головастиках содержатся нейроны, подходящие для визуализации, головастиков анестезируют, затем помещают в камеру в форме сигары и накрывают покровным стеклом. После этого мозг каждого головастика быстро осматривают под эпифлуоресцентным светом, чтобы определить наличие одиночных флуоресцентно меченных нейронов. Обратите внимание, что чрезмерное воздействие эпифлуоресцентного света приведет к фототоксичности, которая может вызвать гибель меченой клетки. Поэтому старайтесь свести к минимуму время воздействия флуоресцентного света на клетки.

В случае использования декстрановых красителей скрининг можно проводить уже через 30 минут после электропорации. Однако мы обнаружили, что более длительные интервалы способствуют снижению уровня фоновой флуоресценции. При использовании плазмид скрининг ДНК обычно проводится не ранее чем через 12 часов после электропорации.

Для флуоресцентного мечения нейронов в оптическом тектоме головастика мы регулярно используем электропорацию одиночных клеток. Наш двухфотонный микроскоп собран по индивидуальному заказу на базе конфокального микроскопа Olympus FV 300 и лазерного источника света Chameleon XP. Для визуализации зеленой флуоресценции мы обычно используем длину волны 910 нанометров.

После того как мы находим головастика с одним меченым нейроном AL и помещаем его на установку для двухфотонной микроскопии, мы приступаем к интервальной двухфотонной визуализации тактильных нейронов через различные промежутки времени. Это позволяет нам наблюдать динамику роста дендритных разветвлений клеток AL. Здесь представлен пример экспрессирующего GFP нейрона, который был мечен с помощью электропорации единичных клеток.

Данное изображение было получено с помощью двухфотонной микроскопии in vivo для количественной оценки роста нейронов. Обычно создаются скелетизированные трехмерные реконструкции каждого изображения нейрона. Таймлапс-визуализация с длительными интервалами позволяет изучить долгосрочные последствия экспериментального воздействия.

Здесь представлен незрелый нейрон, экспрессирующий GFP, который подвергался ежедневному имиджингу в течение четырех дней, охватывающих период развития его дендритного дерева. Данные изображения были получены с помощью двухфотонной микроскопии и представлены в виде Z-проекций. Быстрая интервальная съемка позволяет наблюдать за динамикой процессов нейронального роста, включая формирование и ретракцию дендритных филоподий.

В данном видео показан относительно зрелый GFP-экспрессирующий нейрон, съемка которого велась в трех измерениях каждые две минуты в течение одного часа. Здесь представлен пример незрелого GFP-экспрессирующего нейрона, съемка которого проводилась каждые пять минут в течение часа. Молодые нейроны весьма динамичны и демонстрируют интенсивный рост и ретракцию ветвей.

При увеличении этого нейрона, экспрессирующего GFP, видно постоянное появление и сокращение дендритных филоподий, что типично для развивающихся нейронов в данной системе. Прозрачность головастика-альбиноса и доступность его мозга делают эту модельную систему идеально подходящей для визуализации роста нейронов и внутриклеточных событий в живом организме. Электропорация единичных клеток позволяет нам визуализировать рост одного нейрона и проводить автономные клеточные манипуляции в остальном неизменном мозге.

Мы только что продемонстрировали вам, как проводить электропорацию единичных клеток в *Xenopus laevis* tadpole (головастиках), хотя в данном случае наше внимание сосредоточено на электропорации именно головастиков. Этот метод применялся и для других организмов, а также для срезов гиппокампа и культур диссоциированных клеток. При выполнении данной процедуры важно постоянно корректировать кончики пипеток и параметры стимуляции для поддержания высокого выхода.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.