Оптимизированный протокол по инфекции Candida albicans в среднесредиземноморье Schmidtea для изучения патогенезов грибков и защиты хозяина

Мои исследования сосредоточены на инфекциях Candida albicans и на том, как реакция хозяина влияет на исход — это очищение или прогрессирование заболевания. Ключевой проблемой является отсутствие моделей ранних грибковых инфекций. Этот протокол использует планарий как управляемое, высокопроизводительное решение.

Планарная система позволяет изучать инициацию, прогрессирование, очищение и летальность заболевания, с высоким разрешением измерения врождённых иммунных ответов. Для начала выберите планарии Schmidtea mediterranea длиной примерно пять миллиметров под стереомикроскопом и убедитесь, что животные полностью вытянуты перед измерением. Избегайте использования планарий меньше пяти миллиметров, так как они могут включать людей с бластемами или неполным развитием, что может дать нестабильные результаты.

Также исключайте планарные растения больше пяти миллиметров, так как крупные животные менее подходят для флуоресцентного иммуноокрашивания. Исключайте животных с бластемами, тканями без пигментации или неполным развитием пигментации. Переместить здоровую планарийную воду, соответствующую всем критериям включения, в два миллилитра свежей планарной воды на скважину в шести-полистироловой пластине, не обработанной тканевыми культурами.

Назначить колодцы для отрицательных контролей, состоящих из неинфицированных или имитированных животных, и положительных контролей, содержащих животных, инфицированных диким типом Candida albicans. Удалите всю воду из каждой скважины и замените на два миллилитра свежей планарной воды для обеспечения равномерности между колодцами. Позвольте животным уравновеситься в новой среде в течение одного дня до заражения.

Наклоните пластину с шестью колодцами и аккуратно удаляйте всю воду из одной скважины за раз, используя асептическую технику. Сразу же добавьте рассчитанный объём планарной воды и культуры Candida albicans в колодец перед переходом к следующему колодцу. Запишите дату и время прививки.

Поместите инокуленную пластину с шестью лунками в тёмном, статичном месте при комнатной температуре. Инкубировать планарию с Candida albicans до 72 часов, в зависимости от желаемой конечной точки. В первую точку, через 24 часа после заражения, слегка наклоните пластину.

Затем, используя стерильную трансферную пипетку, аспирируйте жидкость с культурой Candida albicans и аккуратно введите её в участок колодца, свободный от животных, чтобы смешать оседшийся грибковый слой. Повторяйте этот шаг от пяти до десяти раз на каждую скважину, чтобы разрушить осевший грибной слой, избегая прямого контакта с планариями. Наблюдайте за оседанием грибов на тёмном фоне до и после этапов подвески для лучшей видимости.

Приостановить незаражённые контрольные скважины при аналогичных условиях. Повторите эту процедуру через 48 часов после заражения. Через 72 часа после заражения перенесите планарии в свежие колодцы с двумя миллилитрами чистой воды, минимизируя перенос грибков за счёт минимального использования жидкости.

После переноса животных удалите всю воду и замените её свежей планарной водой. Начинайте оценивать результаты хозяина через день после заражения и продолжайте ежедневно до желаемой экспериментальной точки. Количественно оценивайте урон хозяина с помощью стандартизированной системы оценки от нуля до трёх.

Через три дня после заражения аккуратно перенесите планарий на новую пластину с шью колодцами, содержащую по два миллилитра свежей планарной воды на каждую колодец, при этом избегая переноса остаточной грибковой культуры. Наблюдайте животных с помощью световой микроскопии с минимум 10-кратным объективом. Фиксируйте результаты хозяев с помощью стандартизированного таблицы оценок.

Кроме того, можно провести иммунокрашивку против кандиды для наблюдения грибковой колонизации эпителия хозяина во время инфекции и очищения. Колонизация грибкового эпителия значительно уменьшилась через четыре дня после заражения, а через семь дней после заражения почти все грибы, связанные с поверхностью, были устранены при условиях ID50. Неинфицированные контроли оставались полностью бессимптомными.

При примерно 7,0 умножении на 10 к мощности семи клеток Candida albicans на миллилитр, около 30% были бессимптомными, 50% — симптоматическими, и 20% — мертвыми. При примерно 8,0 умножении на 10 к мощности семи клеток Candida albicans на миллилитр, около 30% были бессимптомными, 20% — симптоматическими, и 50% — мертвыми. Медианная выживаемость снизилась с примерно 90% при 7,0 умножить на 10 до мощности семи клеток Candida albicans на миллилитр до примерно 50% при 8,0 умножить на 10 до мощности семи клеток на миллилитр и до менее чем 25% при 8,5 умножить на 10 до мощности семи клеток на миллилитр.

Общая выживаемость составляла около 50% у планариев, инфицированных дикой Candida albicans, примерно 8,0 раз на 10 уровней мощности семи клеток на миллилитр, по сравнению с 100% выживаемости у неинфицированных контрольных групп. Этот протокол позволяет in vivo изучать динамику хозяина и патогена, интегрируя визуализацию и молекулярные подходы в генетически управляемого хозяина. Будущие применения включают высокопроизводительный скрининг мутантов, сравнительные исследования среди микробных видов и адаптацию для токсикологических и тестов эффективности лекарств.