Эффективный и быстрый метод HPLC-QQQ-MS для количественного определения тропановых алкалоидов в лекарственных растениях

Мы разработали метод HPLC-QQQ-MS для быстрой количественной оценки трёх основных тропанных алкалоидов в Anisodus tanguticus. Обычные ВЭЖХ не обладают чувствительностью к тропановым алкалоидам. Этот метод использует высокочувствительную масс-спектрометрию для решения этой задачи.

Для начала точно взвесьте 10,0 миллиграммов гидробромида гиосциамина, анизодамина и гидробромида скополамина. Положите их в отдельную 10-миллилитровую объёмную колбу. Добавьте хроматографический метанол на отмеченную линию в каждой объёмной колбе.

Тщательно растворите стандарты с помощью ультразвуковой обработки для получения единого стандартного раствора с концентрацией 1,0 миллиграмма на миллилитр. Затем переложите стандартные растворы в бутылки с коричневым реагентом и храните при температуре 4 градуса Цельсия в темноте. Для приготовления смешанного стандартного промежуточного раствора 10 микрограммов на миллилитр пипеткой 100 микролитров каждого ранее подготовленного раствора в 10-миллилитровую колбу объема.

Затем добавьте хроматографический метанол к отмеченной линии, чтобы разбавить раствор. Далее проведите сублимационную сушку свежего материала Sophora flavescens. Затем, используя высокоскоростную кофемолку, измельчите высушенный материал в однородный порошок.

Просейте порох через стандартное тестовое сито диаметром 0,25 миллиметра. Точно взвесьте 20 миллиграммов просеянного порошка. Переложите его в 100-миллилитровую объёмную колбу и добавьте хроматографический метанол чуть ниже отмеченной линии.

Затем проведите ультразвуковое извлечение при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем достаните объёмную колбу и дайте ей остыть до 25 градусов Цельсия при комнатной температуре. Добавьте хроматографический метанол в 100-миллилитровую линию и вихрь для смешивания в течение двух минут.

Затем пипеткой набейте один миллилитр приготовленного экстракта в 100-миллилитровую объёмную колбу. Добавьте метанол в отмеченную линию. Хорошо встряхните, чтобы тщательно перемешать, и получите материнский раствор для инъекции ВЭЖХ.

Для фильтрации образцов подготовьте одноразовый безигольный шприц объемом 1 миллилитр и микропористую органическую мембрану диаметром 0,22 микрометра. Аспирируйте 1,2 миллилитра материнского раствора для инъекции в шприц и отфильтруйте раствор, медленно проталкивая его через мембрану. Соберите фильтрат в двухмиллилитровый флакон с внутренней вставкой и плотно запечатайте флакон крышкой.

Подготовьте мобильную фазу A, измерив 1000 миллилитров ультрачистой воды. Добавьте 1,0 миллилитра муравьиной кислоты хроматографического класса и равномерно перемешайте с помощью магнитной мешители в течение 10 минут. Далее подготовьте мобильную фазу B, используя хроматографический метанол напрямую без дополнительной обработки.

Дегазирующие фазы A и B при 40 килогерц в течение 15 минут с использованием отдельных ультразвуковых установок дегазации. Подключите дегазированные подвижные фазы в отдельных баллонах с растворителем к соответствующим линиям A и B системы ВЭЖХ. Для хроматографического разделения используйте столбец C18.

Уравновесить колонку с метанолом и водой в соотношении 80 к 20 в течение 30 минут при расходе 0,3 миллилитра в минуту. Установите температуру духовки на 30 градусов Цельсия и заранее разогрейте 10 минут. Затем установите расход 0,60 миллилитра в минуту, объём впрыска — два микролитра, а длину волны обнаружения — 210 нанометров.

После этого задайте программу градиентного элюирования с указанными условиями. Выполнять масс-спектрометрическое обнаружение с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра, оснащённого источником ионизации электроспреем, работающим в режиме положительной ионизации. Установить давление небулайзера на 15 фунтов на квадратный дюйм, капиллярное напряжение на 4 000 вольт, температуру газа на 300 градусов Цельсия и поток газа на 11 литров в минуту.

Затем задайте параметры для нескольких пар ионов мониторинга реакций. Для идентификации ионов-предшественников напрямую вводите отдельные стандартные растворы в режиме сканирования MS2. После валидации метода проводите сбор данных в режиме мониторинга множественных реакций.

Используйте оптимизированные параметры, включая ион-прекурсор, переходы ионов произведения, напряжение фрагментора и энергию столкновений для каждого анализа, как показано здесь. Запустите программное обеспечение для качественного анализа. Выберите файл и выберите импорт данных, чтобы импортировать все собранные файлы.

Проверьте пиковую симметрию и согласованность времени удержания целевых пиков в каждой извлеченной ионной хроматограмме. В модуле количественности выберите переход MRM. Введите пары ионов-предшественников и продуктовых ионов для каждого компонента и извлеките соответствующие экстракцированные ионные хроматограммы.

Рассчитайте пиковую область для количественного анализа. Все три целевых тропановых алкалоида были успешно разделены в течение 20 минут при оптимизированных условиях ВЭЖХ. Разрешение между скополамином и анизодамином составляло 8,67.

Хотя показатель между анизодамином и гиосциамином достиг 11,58, все значения разрешения значительно превышали базовый критерий разделения в 1,5. Все анализируемые вещества показали хорошую линейность в диапазоне концентраций от 0,014 до 0,320 микрограмм на миллилитр с коэффициентами корреляции более 0,99. Среднее выздоровление составило 101,44% для скополамина, 100,25% для анизодамина и 99,56% по гиосциамину, с относительными стандартными отклонениями 1,85%, 2,35% и 1,9% соответственно.

Количественная оценка трёх тропанных алкалоидов в 10 образцах Anisodus tanguticus показала, что содержание скополамина варьировалось от 0,3667 миллиграмм на грамм в шестом образце до 1,0356 миллиграмм на грамм в семьом образце. Содержание анизодамина варьировалось от 0,0269 миллиграмма на грамм в шестом образце до 0,3590 миллиграмм на грамм в десятом образце. Содержание гиосциамина варьировалось от 0,2930 миллиграмма на грамм во втором образце до 1,4989 миллиграмм на грамм в десятом образце, при этом более высокие уровни наблюдались в четвёртых, седьмых, девятых и десятых образцах.

Этот протокол позволяет быстро и точно количественно определить три основных тропановых алкалоида. Ключевая задача — обеспечение процедур с использованием приборов и стандартизированную подготовку образцов для точного измерения. Этот метод можно расширить для изучения и количественной оценки других метаболитов в Anisodus tanguticus.