Выделение и валидация подпопуляций мезенхимальных стволовых клеток с положительными подопланинами с использованием стратегии косвенного магнитного шарика

Наши исследования были сосредоточены на выделении специфических подмножеств мезенхимальных стволовых клеток для экономичного размягчения магнитных шариков с высокой чистотой и читаемостью. Этот протокол может применяться к любому мембранному белку с использованием стандартных ПЭ-конъюгированных антител. Для начала соберите необходимые реагенты.

Выберите мезенхимальные стволовые клетки (MSC) из проходов с третьего по пять, достигших слияния от 80 до 90%. Отбросьте культурный медиум. Промой клетки дважды 10 миллилитрами предварительно подогреного PBS.

Аккуратно раскачивайте сосуд и отбросьте PBS. Добавьте два миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубуйте при 37 градусах Цельсия в течение трёх-пяти минут. Под микроскопом наблюдайте за клетками, пока они не округлят и не начнут отделяться.

Добавьте четыре миллилитра посевной среды с 16,5% FBS для нейтрализации трипсина. Аккуратно пипетируйте клетки, чтобы обеспечить полное отслоение, и перенесите суспензию клетки в 15-миллилитровую центрифугную трубку. Центрифугуйте суспензию ячейки при 300 г в течение трёх минут и сбросьте супернатант.

Заново суспензировать клеточную гранулу в один миллилитр буфера. Посчитайте ячейки, чтобы определить общее количество ячейки. Центрифугуйте и уберите супернатант, как было показано ранее.

Заново суспенгируйте клетки с помощью буфера, чтобы получить плотность 100 миллионов клеток на миллилитр. Перенесите подвеску ячейки в пятмиллилитровую полистироловую трубку с круглым дном. Добавьте 10 микролитров блокатора Fc гамма-RII на 10 миллионов клеток.

Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте пять микролитров конъюгированного фикоэритрина, или ПЭ-конъюгированного, античеловеческого подопланина или антитела PDPN, на 10 миллионов клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 15–20 минут, защищённых от света.

Добавьте 10 микролитров селективного коктейля на 10 миллионов клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 15 минут. Используйте вихревой миксер, чтобы энергично перемешать флакон с магнитными шариками в течение 30 секунд.

Добавьте пять микролитров магнитных шариков на каждые 10 миллионов клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Поместите пятмиллилитровую полистироловую трубку с круглым дном с промеченным образцом ячейки в магнитную сепарацию.

Добавьте буфер в трубку, чтобы увеличить общий объём до 2,5–3 миллилитров. И инкубировать при комнатной температуре пять минут. Удерживая магнит и трубку как единое целое, инвертируйте их, чтобы налить супернатант в новую сборную трубку.

Поместите собранную фракцию PDPN-отрицательной клетки на лёд. Повторите процедуру магнитного разделения три раза, как было показано ранее, заливая супернатант в одну и ту же PDPN-пробирку с отрицательной фракцией после каждого отделения. После финальной промывки удалите трубку, содержащую магнитно связанную долю положительной ячейки PDPN, из стойки магнитного разделения.

Добавьте три миллилитра буфера, чтобы снова суспензировать положительные клетки. Перенесите суспензию положительной фракции в свежемаркированную трубку. Посчитайте клетки как из положительных, так и из отрицательных фракционных трубок.

Запишите выход ячеек для каждой дроби. Центрифугуйте суспензию положительной фракции при 300 г в течение трёх минут и отбросьте супернатант. Повторная суспензия клеточной гранулы в среде MEM альфа-культуры с содержанием 16,5% FBS.

Регулируйте плотность клеток по мере необходимости и засевайте клетки в культиваторные пластины или колбы. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа. После подсчёта клеток засейте их в 100-миллиметровую культурную чашу с плотностью три миллиона клеток на чашу в 12 миллилитрах культурной среды.

Через 24 часа после посева наблюдайте за присоединением клеток. Замените культурную среду на свежую, чтобы удалить остаточные магнитные шарики и неприлипающие клетки. Собирайте клетки с помощью трипсинизации.

Аккуратно пипетируйте подвеску клетки вверх и вниз 10–15 раз, чтобы вытеснить и удалить магнитные шарики и остаточные антитела. Оценить процент ПЭ-положительных клеток PDPN с помощью потоковой цитометрии. Собирайте клетки во время логарифмической фазы роста.

Засейте клетки в пластину с 96 колодцами. В разные моменты времени добавляйте реагент Cell Counting Kit-8m или CCK-8 и измеряйте поглощение согласно инструкции производителя. Сделайте табуляцию данных предварительной и послесортировки для разных временных точек в программном обеспечении GraphPad Prism, затем нажмите на данные, чтобы построить кривую распространения.

После блокировки FC-рецепторов, маркировки антител и магнитного разделения итоговое количество клеток составило примерно 3,5 миллиона клеток для PDPN-положительной фракции и 6,4 миллиона клеток для PDPN-отрицательной фракции. До магнитной сортировки частота PDPN-положительных клеток в исходной популяции составляла 38,7%. После сортировки положительная фракция содержала 97,9% PDPN PE-положительных клеток. Анализ проточной цитометрии отрицательной фракции показал, что 4,30% положительных клеток PDPN осталось, что свидетельствует об эффективном истощении положительных клеток PDPN по сравнению с отрицательной фракцией.

Кривая пролиферации PDPN-положительных клеток в течение трёх последовательных дней культуры не показала значимых различий по сравнению с неотсортированными MSC, что указывает на то, что стратегия сортировки не вызывала заметного снижения пролиферации или метаболической активности на основе CCK-8 по сравнению с неотсортированными MSC. Такой подход позволяет исследованиям изучать субпопуляцию с высокой чистотой и читаемостью. Самое важное в этом протоколе — мягкость для поддержания читаемости клетки и удаление незавязанных шариков.

Следуя этой процедуре, исследования могут проводить пролиферационные анализы, а также осадочные и дефляционные исследования.