Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Митохондрии играют множество ролей в физиологии клеток: от метаболизма и производства энергии до программирования гибели клеток и синтеза стероидных гормонов. Несмотря на важность митохондрий как в основных клеточных функциях, так и в заболеваниях, очень мало известно о функции митохондрий в эмбриональных стволовых клетках человека и их дифференцированном потомстве. В этом видео мы покажем вам, как можно проанализировать комплексы дыхательных цепей митохондрий стволовых клеток амри человека с помощью анализов активности Ингеля.

Здравствуйте, я Иван О.В. из лаборатории Майкла Тетеля на кафедре патологии и лабораторной медицины Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Сегодня мы покажем вам процедуру оценки функции митохондриального дыхательного комплекса в эмбриональных стволовых клетках человека. Эта процедура включает выделение грубого митохондриального нёба из эмбриональных стволовых клеток человека, разделение митохондриальных комплексов экссудативной системы фосфорилирования с более высоким разрешением, электрофорез в прозрачном нативном полиакриламидном геле, а затем SA в гелевой активности.

Итак, приступим. Первым шагом в этой процедуре является выделение митохондрий из эмбриональных стволовых клеток человека. Для этого анализа мы будем использовать человеческие эмбриональные стволовые клетки, которые были выращены на покрытой матригелем пластине в состоянии без кормушки.

Чтобы собрать митохондрии из человеческих стволовых клеток, мы сначала промываем их теплой жидкостью XPDS pH 7,4, а затем трипсином клетки в течение пяти минут. Вы можете использовать один мил одного х трипсина на лунку в шестилуночном планшете. Через пять минут можно остановить реакцию, добавив равный объем свежего ингибитора трипсина один миллиграмм на мил в один XPBS и собрать клетки.

Затем собранные клетки центрифугируют при 200-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре. После вращения выбросьте надосадочную жидкость и резус, суспензируйте гранулированные клетки в 0,8-1,7 мл ледяного буфера для изоляции митохондрий со свежеприготовленным коктейлем из одного ингибитора протеазы. Сколько буфера вы используете, зависит от размера клеточной гранулы, которую вы получаете После того, как гранула была ресуспендирована, инкубируйте ее на льду в течение примерно 10 минут.

После инкубации мы погружаем клетки с помощью гомогенизатора, это может занять от 40 до 50 ударов. Мы можем проверить полный список гомогенизации, окрашивая аликвоту клеток DOD триановым синим и глядя в световой микроскоп. Выглядеть это должно примерно так.

Это первый удар после 50 ударов с дауном. Это второй удар после 80 ударов с даунами. После того, как клетки будут гомогенизированы, центрифугируйте их при температуре 20 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Это даст нам сырую митохондриальную гранулу, которая также будет содержать ядра и более крупные фрагменты клеток.

Перед сбором гранулы мы должны взвесить сборную трубку, чтобы оценить последующий вес гранулы, высыпать и отбросить надосадочную жидкость, а затем взвесить осажденную сырую митохондриальную гранулу. Вычитая вес трубки в этом месте, можно приступать к солюбилизации гранулы, которая будет показана на следующем этапе. Чтобы солюбилизировать сырую митохондриальную гранулу, мы начинаем с удержания гранулы на льду и закручивания с 35 микролитрами ледяного солюбизационного буфера.

На каждые 20 миллиграммов гранул, которые у нас имеют подробную информацию о буферных соединениях, указывается в сопроводительном письменном протоколе. После вортексирования и добавления солюбилизационного буфера и перед добавлением пальцевого тоина мы переносим ресуспендированную гранулу в пробирку, подходящую для высокоскоростного центрифугирования, а затем добавляем 20 микролитров 10% веса на объем для 20 миллиграммов веса гранулы и перемешиваем, переворачивая пробирку после того, как она была тщательно перемешана, инкубируем митохондриальную гранулу в течение пяти-10 минут на льду. Doil beta D multiside или DDM или Triton X 100 могут быть заменены на солюбилизированные белки.

Выбор детергента и его количества может повлиять на образование супракомплексов или мультимерных форм митохондриальных комплексов после инкубации на льду. И как только гранула растворится, мы центрифугируем ее при температуре в сто тысяч раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем мы собираем прозрачную надосадочную жидкость. Теперь мы готовы подготовить надосадочную жидкость для работы на нашем градиентном геле для нативного градиентного гелевого электрофореза митохондрий.

Мы рекомендуем использовать акриламидный градиентный гель от пяти до 13% с 3,5% стекирующим гелем. Для приготовления геля мы будем использовать смесь акриламида и акриламида, как описано в письменном протоколе. Акриламид бис акриламид раствор готовится заранее и хранится при температуре четыре градуса Цельсия в темном месте.

Акриламид и бис-акриламид являются токсичными химическими веществами как в виде порошка, так и в жидкой форме, поэтому при работе с ними следует уделять особое внимание. Мы комбинируем раствор акриламида биса с аликвотой из трех х гелевого буфера, состоящего из 1,5 моляра шести аминокислот гексаноевой кислоты и 75 миллимоляров оле при pH 7,0. Количество акриламида и раствора акриламида, которое мы добавляем в буфер, будет зависеть от процента геля, который мы производим для получения градиентного геля.

Мы сделаем одну 4%-ную смесь и одну 13%-ную смесь, а стекирующий гель будет 3,5%-ной смесью. Не забудьте добавить в смесь 13% глицерин. Когда все три смеси будут готовы, мы добавляем в смеси соответствующее количество аммония на сульфат и темид и заливаем смеси в градиентную камеру формовки.

Левая часть камеры содержит 5%-ную смесь. Правая часть камеры содержит 13%-ную смесь в небольшой магнитной мешалке. Начинаем заливать гель, открывая правую часть камеры.

Затем сразу же открываем левую часть камеры и даем 5% раствору смешаться с 13% раствором, чтобы получить градиент. В верх геля добавляем небольшое количество изопропанола, чтобы после полимеризации образовалась острая прямая граница для геля. Примерно через час, когда полимеризация градиентного геля завершена, мы удаляем изопропанол и заливаем стекирующий гель 3,5 в аппарат и вставляем гелевую расческу.

Мы соберем и запустим гели в холодном помещении с температурой от четырех до семи градусов по Цельсию. Чтобы запустить этот гель, мы будем использовать два разных буфера. В анодной камере мы будем использовать буфер, содержащий 25 миллимоляров оле соляной кислоты pH 7,0.

Катодный буфер будет содержать 50 миллиметров, 7,5 миллимоляра оле соляной кислоты, 0,02% от массы к объему, фольгу бета D или ДДМ и 0,05% от массы к объему, дезоксикоат pH 7,0. Для того, чтобы подготовить надосадочную жидкость для запуска в гель, который мы только что залили, добавляется загрузочный буфер для получения конечной концентрации 5% от веса к объему и 0,01% от веса к объему. Ponto S мы обычно добавляем 10 x стоковый раствор, содержащий глицерин и poncho S, непосредственно к надосадочной жидкости.

Теперь мы готовы загрузить образец геля на гель. Мы загрузим гелевые лунки объемом, содержащим от 20 до 40 миллиграммов сырого митохондриального белка на линию. Сразу после загрузки гель запускается при напряжении 100 вольт.

После того, как образец вошел в стекирующий гель, напряжение может быть повышено до 500 вольт с током, ограниченным 15 миллиамперами. Хотя мы обычно запускаем гель на ночь при напряжении от 70 до 100 вольт, мы останавливаем электрофорез, когда острая линия красного красителя зос приближается к фронту геля. Теперь, когда гель запущен, мы можем анализировать активность различных белковых комплексов непосредственно в геле.

Время инкубации для каждого анализа зависит от эффективности солюбилизации белка и количества загружаемого материала в одну лунку. Комплексы один, четыре и пять обычно дают более сильные сигналы, чем комплексы 2 и 3. Вот почему время окрашивания для второго и третьего комплекса должно быть больше.

Чтобы протестировать сложную активность, нам нужно будет использовать определенные буферы для каждого комплекса. Ингредиенты для отдельных буферов вы можете найти в письменном протоколе. Теперь мы вырежем отдельные полосы геля для выполнения анализов активности Ингеля отдельно.

Для всех комплексов инкубируйте срез геля в соответствующих буферах в течение нескольких часов при комнатной температуре для всех комплексов, кроме комплекса 5. После инкубации закрепите гель в 50% метанола и 10% уксусной кислоты на 15-45 минут. Несъемный гель содержит 10% уксусной кислоты.

Здесь вы видите, как проявляется окрашивание сложного. В срезе геля есть одна темно-фиолетовая полоса, которая соответствует сложной. Прозрачные гели позволяют выполнять денситометрию по активности митохондриальных комплексов и проводить сравнительные анализы.

После плотной цитометрии мы обычно высушиваем срезы геля для длительного хранения и/или для сканирования с целью получения высококачественного изображения комплекса, двух окрашиваний такого же фиолетового цвета, как одно сложное три и сложное четыре. Оба дают оранжевую или желтоватую полосу окрашивания. Вот примеры сложных действий по окрашиванию с двумя, тремя и четырьмя красителями.

Мы только что показали вам, как анализировать активность митохондриальных экссудативных комплексов, которые были выделены из эмбриональных стволовых клеток человека и разделены с более высоким разрешением, включая нативные гелевые электросети. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.