Создание плюрипотентных Клетки MEFS через принудительный Выражение Sox-2, Oct-4, с-Myc, и Klf4

Более 50 лет назад была выдвинута гипотеза о том, что терминально дифференцированные клетки, такие как фибробласты кожи, могут быть принудительно переведены в плюрипотентное состояние, сходное с состоянием эмбриональных стволовых клеток. В основе этой концепции лежало наблюдение, что все типы клеток, за несколькими редкими исключениями, обладают одинаковым генетическим кодом и что единственным различием между типами клеток является способ считывания этого кода. Способность изменять клеточную идентичность дифференцированной клетки, переводя ее в плюрипотентное состояние, называется клеточным репрограммированием.

После пяти лет исследований недавно было показано, что принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции может перепрограммировать фибробласты кожи, делая их плюрипотентными. Значимость этого открытия огромна. Помимо важности для фундаментальной биологии, оно также позволяет преодолеть основные этические возражения против использования человеческих эмбриональных стволовых клеток для трансплантационной терапии.

Для того чтобы произошло перепрограммирование, четыре гена, кодирующих факторы транскрипции Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4, должны быть упакованы и введены в лентивирус. Затем среда для культивирования тканей, содержащая очищенный вирус, добавляется в чашку с клеточной культурой с высокой плотностью фибробластов, и в этой чашке происходит удивительный процесс. Небольшая часть фибробластов заражается всеми четырьмя вирусами, несущими факторы транскрипции, и начинает подвергаться дедифференцировке.

Они претерпевают резкие изменения морфологии и пролиферации и начинают разделяться, в результате чего формируются крупные сферические кластеры плюрипотентных стволовых клеток. После двух-трех недель культивирования в условиях для эмбриональных стволовых клеток колонии репрограммированных фибробластов можно выделить вручную и экспансировать in vitro. После очистки эти клетки могут быть использованы для создания химерных мышей, в которых определенный процент клеток, происходящих от этих дедифференцированных фибробластов, может вносить вклад в формирование различных тканей мыши.

В химерах, в которых генетический материал исходных фибробластов попал в зародышевую линию, генетический код будет передаваться следующему поколению, а затем последующим. Хотя использование вирусной системы доставки в настоящее время является препятствием для клинического применения, эта проблема, вероятно, будет решена в ближайшее время. В этом видео сотрудники лаборатории Йина продемонстрируют, как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки получают из эмбриональных фибробластов мыши.

Здравствуйте, я Грант Велтед из лаборатории Рудольфа Яша в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда в Кембридже, штат Массачусетс. А я Тобиас Бробринк, также из лаборатории Яша. Сегодня мы продемонстрируем вам получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток путем введения четырех кДНК — OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC — с помощью лентивирусов, экспрессирующих эти четыре кДНК под управлением Tet-On CMV промотора.

Это позволяет точно контролировать экспрессию четырех трансгенов после инфицирования эмбриональных фибробластов мыши. Представляемый сегодня протокол включает работу с лентивирусом, который может инфицировать клетки человека. Крайне важно всегда соблюдать правила техники безопасности и проконсультироваться с отделом по охране труда перед самостоятельным выполнением данной процедуры.

Итак, давайте создадим iPS-клетки, чтобы получить лентивирус, который будет преобразовывать мезенхимальные клетки в iPS-клетки. Клетки 293 должны быть трансфицированы тремя плазмидами: Pak2, которая обеспечивает необходимые генетические элементы для упаковки вируса; вирусным остовом, представляющим собой лентивирус FUW TE OCMV с одним из четырех факторов CD: T4, SOX2, KLF4 или c-MYC; и pMDNG, которая экспрессирует гликопротеин оболочки вируса везикулярного стоматита или VSV.

В результате получается вирус, который будет генерировать атрофический вирус. Поэтому необходимо строго соблюдать процедуры уровня биобезопасности BL2+. В данном конкретном видео мы не работаем с инфекционным вирусом, поэтому на нас нет стандартных халатов, и мы находимся не в помещении уровня BL2+.

Перед трансфекцией клетки 2, 9 3 размораживают из жидкого азота и выращивают до 90% конфлюэнтности. Затем клетки трансфицируют геном FU и инкубируют в течение 48–72 часов для экспрессии вируса, после чего среду, в которой находились клетки, фильтруют через фильтр 0,45 мкм и концентрируют с помощью ультрацентрифугирования. После концентрирования вируса мы можем приступать к заражению MEF для генерации кластеров iPS. Во время этапов подготовки вируса эмбриональные фибробласты мыши с количеством пассажей менее трех выращивают до 90% конфлюэнтности в чашках диаметром 10 см, примерно по 2 × 10⁶ клеток на чашку. В данном конкретном экспериментальном протоколе мы используем MEF, экспрессирующие RTTA, что критически важно для экспрессии доксициклина, и GFP из эндогенного локуса OCT4.

MES являются GFP-отрицательными, тогда как истинные ИПСК становятся GFP-положительными. Этот маркер позволяет использовать метод идентификации репрограммированных мез. Отсосите культуральную среду из фибробластов и промойте их 10 мл раствора HPBS с ЭДТА, удалите раствор HPBS с ЭДТА, добавьте 5 мл 1-кратного трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут. Трипсин поможет отделить клетки от дна чашек.

Теперь добавьте 9 мл культуральной среды, чтобы ресуспендировать клетки до состояния одноклеточной суспензии, и перенесите ее в пробирку объемом 15 мл. Затем клетки центрифугируют для получения осадка. После ресуспендирования осадка подсчитывают количество клеток в суспензии и доводят концентрацию до 8 × 10⁴ клеток/мл.

Затем 10 мл клеточной суспензии переносят в чашку диаметром 10 см, покрытую желатином. Инкубируют чашку в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. После ночной инкубации среду из чашки с фибробластами аспирируют и добавляют 10 мл среды, содержащей вирус. Инкубируют клетки от четырех часов до ночи при 37 °C и 5% CO2.

На следующий день аспирируйте среду из чашки с фибробластами, затем добавьте 10 мл свежей среды ESL. На этом этапе клетки можно подвергнуть криоконсервации, экспансии или подготовить к началу репрограммирования. Для инициации репрограммирования замените обычную среду ESL средой, содержащей доксициклин, для запуска экспрессии четырех генов.

Поместите эти клетки в инкубатор, ежедневно заменяя среду, пока колонии не достигнут размера, достаточного для пикирования. Колонии должны стать видимыми примерно через неделю после начала репрограммирования. К 20-му дню они должны достичь размера, позволяющего их пикировать.

По прошествии 20 дней можно приступать к отбору колоний ИПСК. Необходимо подготовить нужное количество 24-луночных планшетов, покрытых желатином с гамма-облученным DR, за один-два часа до начала процедуры. Перед отбором колонии на планшетах следует подкормить, добавив свежую среду. Непосредственно перед отбором в лунки V-образной 96-луночной планшетки добавьте 50 µL HEPES-буфера. Планшет с колониями, предназначенными для отбора, промойте один раз PBS и добавьте в него 10 mL PBS. Отбор кластеров клеток ИПСК можно проводить с помощью стереомикроскопа или инвертированного микроскопа.

С помощью наконечника маленькой пипетки выберите колонии и перенесите их в лунку 96-луночного планшета с PBS для удаления кластеров. Наконечником пипетки вокруг кластера рисуют круг, чтобы разрушить скопления. Теперь перепрограммированные клетки можно извлечь с помощью многоканального дозатора, добавив в каждую лунку 20 µL трипсина.

Тщательно перемешайте содержимое пробирки путем трехкратного пипетирования, затем инкубируйте при 37 °C в течение четырех минут. После четырехминутной инкубации добавьте 100 µL среды ES к колониям. Перемешайте путем десятикратного пипетирования и перенесите по шесть клонов за один раз.

Перенесите клетки из 96-луночного планшета в 24-луночный, используя наконечники в каждой второй позиции 12-канального дозатора. Затем культивируйте клетки в 24-луночном планшете в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до достижения конфлюентности 80–90%, ежедневно дополняя среду для ЭСК. Клетки, вероятно, будут готовы к экспансии через 3–7 дней. Спустя несколько дней, когда iPS-клетки станут конфлюентными, аспирируйте среду и промойте клетки 1 мл HEPES. Полностью удалите HEPES, добавьте 100 µL 1× трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут. После инкубации с трипсином добавьте 400 µL среды для ЭСК и ресуспендируйте клетки, перемещая жидкость пипеткой вверх-вниз, чтобы получить суспензию из одиночных клеток.

Затем 500 µL суспензии единичных клеток из 24-луночного планшета переносят в одну лунку 6-луночного планшета и инкубируют в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до достижения клетками 80–90% конфлюэнтности в 6-луночном планшете. На этом этапе можно приступить к амплификации клеток для саузерн-блоттинга, получения бластов, проведения инъекций, анализа на тератомы или тестов на дифференцировку in vitro. Также следует не забыть заморозить стоковые культуры этих клеток, чтобы не потерять этот ценный запас ИПСК.

Мы только что продемонстрировали вам способ индуцирования плюрипотентности в эмбриональных фибробластах мыши с использованием индуцибельной антивирусной системы. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.