Создание плюрипотентных Клетки MEFS через принудительный Выражение Sox-2, Oct-4, с-Myc, и Klf4

Более 50 лет назад была выдвинута гипотеза о том, что терминально дифференцированные клетки, такие как фибробласты кожи, могут быть вынуждены принимать плюрипотентное состояние, аналогичное эмбриональным стволовым клеткам. В основу этой концепции легло наблюдение, что все типы клеток, за некоторыми незначительными исключениями, имеют один и тот же генетический код и что единственное различие между типами клеток заключается в том, как код считывается. Эта способность изменять клеточную идентичность дифференцированной клетки до плюрипотентного состояния называется клеточным перепрограммированием.

После пяти лет исследований недавно было показано, что принудительная экспрессия четырех транскрипционных факторов может перепрограммировать фибробласты кожи на плюрипотентные. Влияние этого открытия огромно. Помимо важности для фундаментальной биологии, она также преодолевает основные этические возражения против использования человеческих эмбриональных стволовых клеток для трансплантационной терапии.

Для того, чтобы произошло перепрограммирование, четыре гена, кодирующие факторы транскрипции OC 4, SOX 2 CMIC и K 4, должны быть упакованы и помещены в культуру ткани лентивируса. Затем среда, содержащая очищенный вирус, добавляется в чашку для клеточной культуры, содержащую фибробласты высокой плотности, и внутри этой чашки происходит нечто удивительное. Небольшая часть фибробластов заражается всеми четырьмя вирусами, несущими транскрипционный фактор, и начинает дедифференцироваться.

Они претерпевают радикальные изменения в своей морфологии и пролиферации и начинают делиться на большие духовные кластеры сформированных плюрипотентных стволовых клеток. После двух-трех недель культивирования в условиях эмбриональных стволовых клеток колонии перепрограммированных фибробластов могут быть вручную выделены и расширены in vitro. После очистки эти клетки могут быть использованы для создания химерных мышей, у которых определенный процент клеток, происходящих из этих дедифференцированных фибробластов, может вносить свой вклад в различные ткани мыши.

В курантах, в которых генетический материал исходных фибробластов внес свой вклад в зародышевую линию, генетический код передается следующему поколению, а затем следующему, а затем следующему. Несмотря на то, что использование системы доставки вируса в настоящее время является препятствием для клинического применения, это, вероятно, будет преодолено в скором времени. В этом видео сотрудники лаборатории Инь продемонстрируют, как индуцированные потенцирующие стволовые клетки получают из эмбриональных фибробластов мыши.

Привет, я Грант Велтд из лаборатории Рудольфа Джиша в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда в Кембридже, штат Массачусетс. И я Тобиас Бро Бринк, тоже из ish lab. Сегодня мы покажем вам генерацию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток путем введения четырех CDNA: OCT, четырех SOX, двух CIC KF, четырех с использованием лентивирусов, которые экспрессируют эти четыре CDNA из промотора Tet OCMV.

Это позволяет точно контролировать экспрессию этих четырех трансгенов после инфицирования эмбриональных фибробластов мыши. Протокол, который мы показываем вам сегодня, включает в себя обращение с лентивирусом, который может инфицировать клетки человека. Очень важно, чтобы вы всегда следовали безопасным процедурам и связались со своим отделом безопасности, прежде чем пытаться сделать это самостоятельно.

Итак, давайте создадим несколько IPS-клеток для того, чтобы получить лентивирус, который превратит mes в IPS-клетки. 2 9 3 клетки должны быть трансфицированы тремя плазмидами Paks две, которые обеспечивают необходимые генетические элементы для упаковки вируса. Вирусный костяк, представляющий собой лентивирус FUW TE OCMV с одним из четырех CD вспомогательно T четыре, SOX два, KLA четыре или CMIC PMDG, который экспрессирует гликопротеин оболочки вируса везикулярного стоматита или VSV.

Это делает вирус, который будет генерировать атропный вирус. Таким образом, необходимо следовать правильным процедурам BL два плюса. В этом конкретном видео мы на самом деле не имеем дело с инфекционным вирусом, поэтому мы не носим наши типичные халаты и не находимся в нашем учреждении BL two plus.

Перед трансфекцией 2, 9 3 клетки размораживают из жидкого азота и выращивают до 90% Co fluency клетки затем трансфицируют геном FU и дают от 48 до 72 часов для экспрессии вируса, после чего среду, купающую клетки, фильтруют с помощью фильтра 0,45 микрона и концентрируют с помощью ультрацентрифугирования после концентрации вируса. Теперь мы готовы инфицировать MES для создания кластеров IPS На этапах подготовки вируса прохождение эмбриональных фибробластов мыши менее трех раз увеличивается до 90% беглости в 10-сантиметровых чашках, примерно в два раза по 10 до шести клеток на чашку. В этом конкретном экспериментальном протоколе мы используем MES, экспрессирующие RTTA, что имеет решающее значение для экспрессии доксициклина и GFP из эндогенного четвертого локуса OC.

MES являются GFP-отрицательными, но истинные IPS-клетки становятся GFP-положительными. Этот маркер позволяет использовать метод, с помощью которого можно идентифицировать перепрограммированные mes, аспирировать культуральную среду из фибробластов и промыть 10 милами ЭДТА хиппи, отбросить ЭДТА хиппи и добавить пять мил однократного трипсина и инкубировать при 37 градусах в течение 10 минут. Трипсин поможет поднять клетки со дна посуды.

Теперь добавьте девять мил питательной среды, чтобы ресуспендировать клетки в одноклеточной суспензии и перенесите в пробирку 15 мил. Затем эти элементы раскручиваются вниз и гранулируются. После реактивной суспензии гранулы подсчитывают количество клеток в суспензии и доводят концентрацию до восьми умножить на 10 до четырех клеток на мил.

Затем 10 мил клеточной суспензии переносят в 10-сантиметровую чашку, покрытую желатином. Инкубируйте чашку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия при 5% CO2 после ночной инкубации: среда из чашки с фибробластами отсасывается и в метамфетамин добавляется 10 мил среды, содержащей вирусы. Инкубируйте клетки от четырех часов до ночи при температуре 37 градусов Цельсия, 5% CO2.

На следующий день аспирируйте среду из чашки для струйной обработки, а затем добавьте 10 мил свежей среды ESL. На этом этапе клетки могут быть заморожены, расширены или подготовлены к инициированию перепрограммирования. Чтобы инициировать перепрограммирование, замените обычную среду ESL на среду, содержащую доксициклин, чтобы инициировать экспрессию четырех генов.

Поместите эти клетки в инкубатор, меняйте среду каждый день, пока колонии не станут достаточно большими, чтобы их можно было собрать. Колонии должны впервые стать заметными примерно через неделю после начала перепрограммирования. Они должны стать достаточно большими, чтобы их можно было взять примерно на 20-й день.

Теперь, когда прошло 20 дней, мы можем пойти дальше и выбрать колонии IPS, прежде чем выбирать колонии. Следует помнить о том, чтобы за один-два часа до сбора увидеть необходимое количество покрытых желатином 24-луночных планшетов с гамма-облученным DR четырьмя мифами. Следует кормить колонии на тарелках, добавляя свежую среду непосредственно перед сбором, добавить 50 микролитров буфера HEPA в лунки чашки с V-образным дном 96 Well непосредственно перед сбором, вымыть чашку с колониями, которые нужно собрать, с помощью PBS и добавить 10 мл PBS в чашку

Соберите колонии с помощью маленького наконечника для пипетки и перенесите их в лунку в чашке на 96 лунок, содержащей PBS, чтобы удалить кластеры. Круг с наконечником пипетки рисуется вокруг кластера, чтобы разбить математические вычисления. Теперь перепрограммированные клетки можно извлекать с помощью многоканального дозеттера, в каждую добавляется по 20 микролитров трипсина.

Ну и вниз три раза вверх и вниз, выдерживать при температуре 37 градусов С в течение четырех минут. После четырехминутной инкубации в хорошие колонии триппса добавляют 100 микролитров среды ES. Проведите его вверх и вниз 10 раз и перенесите шесть клонов за раз.

Из чашки на 96 лунок в чашку на 24 лунки с помощью наконечника в каждой другой позиции на 12-луночном планшете пипеттерные клетки затем выращиваются на 24-луночной чашке с 5% CO2-инкубатором до тех пор, пока клетки не достигнут 80-90% CO, подходящие для жидкости с клетками ES, клетки, вероятно, будут готовы к расширению через три-семь дней. Теперь, когда клетки IPS сливаются, аспирируйте среду и полностью промойте клетки одним милом хиппи Удалите хиппи и добавьте 100 микролитров трипсина и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После инкубации с трипсином добавьте 400 микролитров среды ESL и суспензируйте клетки пипетированием вверх и вниз и получите суспензию для одной клетки.

500 микролитров суспензии одиночных клеток из 24 лунок затем переносят в одну лунку шестилуночного планшета и инкубируют в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока клетки не достигнут 80-90% текучести CO в шестилуночном планшете. На этом этапе вы можете приступить к амплификации клеток для южного анализа, бласты, инъекции, анализы тератомы или анализы дифференцировки in vitro. И вы должны не забыть заморозить стоковые клапаны этих элементов, чтобы не потерять этот драгоценный запас элементов IPS.

Мы только что показали вам, как индуцировать плюрипотентность в эмбриональных фибробластах мыши с помощью индуцируемой противовирусной системы. Так что спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.